还原型谷胱甘肽上调β-catenin蛋白表达促进MC3T3-E1细胞成骨分化

陈 伟，王朝晖

（厦门大学附属福州市第二医院骨科，福建福州350007）

骨质疏松症是临床上最常见的一种老年性代谢疾病，常导致骨折等并发症［1］。骨形成过程涉及两个关键的步骤，即骨形成过程和骨吸收过程，两者平衡一旦打破，将会引起一系列骨代谢相关疾病［2］。研究证实，在骨质疏松症患者体内抗氧化酶的活性及含量明显偏低，而活性氧的水平明显偏高［3］。Wnt/β-catenin 信号通路是成骨细胞最关键的信号通路［4］，指导成骨细胞的分化和成熟以及各种成骨相关的重要蛋白分子的表达，是成骨调节的主要通路［5］。

Ning J 等［6］和白晓春等［7］通过双氧水刺激骨髓间充质干细胞验证了活性氧过量及氧应激能抑制骨髓源基质细胞（BMSC）向成骨细胞分化，并降低成骨细胞关键蛋白人类成骨相关转录因子2（RUNX2）、骨形态发生蛋白（BMP）2、Ⅰ型胶原（COLⅠ）、碱性磷酸酶（ALP）的表达，降低成骨能力。Jun J H等［8］通过体外实验验证抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）能降低成骨细胞由于氧应激引起的成骨功能低下，抵抗由活性氧簇（ROS）引起的成骨相关转录因子（OSX）、骨钙素（OC）、COLⅠ、RUNX2、BMP2、BMP4、BMP7、ALP的下降。但是还原型谷胱甘肽（GST）参与骨合成代谢的具体机制尚不十分清楚。本研究探讨GST对未经活性氧处理的成骨细胞的具体作用，为临床上找到一种可靠的促进成骨细胞活性的药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

小鼠前成骨细胞MC3T3-E1购自中国协和医科大学细胞库。GST（sigma公司，美国），用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为 10 mmol/L的储存液，工作液浓度为0.1%；DMEM培养液（Gibco公司，美国）；胎牛血清（FBS）（HyClone公司，美国）；胰蛋白酶（Sigma公司，美国）；碱性磷酸酶染色试剂盒（南京建成科技有限公司）；茜素红粉末（Sigama公司，美国），配成0.1%Alizarin red S-Tris-Hcl（pH 8.3） 待用；PrimeScript RTreagent kit（TaKaRa，日本）；SYBR

PrimeScriptTMRT-PCR Kit II（TaKaRa，日本）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天，中国）；β-catenin鼠单抗（Abcam，美国）；GAPDH 兔多抗（Abcam，美国）；HRP标记山羊抗兔 IgG（H+L）（碧云天，中国）；HRP标记山羊抗鼠 IgG（H+L）（碧云天，中国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MC3T3-E1细胞于α-MEM、10%FBS培养基，成骨诱导液含100 nmol/L地塞米松，0.05 mmol/L 维生素 C，10 mmol/L β-磷酸甘油钠。于37℃，5%CO2，饱和湿度，无菌恒温培养，细胞培养基每3 d传代1次。培养分为两组：对照组（成骨诱导液）与GST组（GST+成骨诱导液）。孵育处理7 d、14 d和21 d后取材。

1.2.2 小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的ALP染色培养MC3T3-E1 7 d后进行ALP染色。传代时加入适量的细胞悬液，培养皿中放入无菌玻片，等待细胞爬满玻片后取出。用PBS洗玻片，冷丙醇溶液固定10 min，蒸馏水反复冲洗丙醇。37℃ALP孵育液中孵育4～6 h，自来水冲洗后，于2%硝酸钴中浸泡3～5 min，蒸馏水冲洗干净。放置于1%的硫化铵中2 min，水洗后干燥，封片，于普通光学显微镜下拍照。

1.2.3 小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的茜素红染色 培养MC3T3-E1 7 d后进行茜素红染色。传代时加入适量的细胞悬液，培养皿中放入无菌玻片，等待细胞爬满玻片后取出。用PBS洗玻片，冷丙醇溶液固定10 min，蒸馏水反复冲洗丙醇。取适量茜素红染色液 0.1%Alizarin red S-Tris-Hcl（pH 8.3）覆盖满细胞，置于37℃培养箱孵育30 min。吸弃液体，PBS洗涤3次/3 min，晾干，拍照。

1.2.4 Real-time PCR基因引物由生工生物公司合成，结果见表1。细胞消化收集，酚氯仿法提取总RNA，验证总RNA完整性，Nano-drop2000测定总RNA样品纯度和浓度。内参基因GAPDH作为内标。

表1 基因引物

1.2.5 Western Blotting 采用RIPA提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒定量，10%SDS-PAGE电泳分离后，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，各自分别按照1∶1 000的稀释比例加入一抗，4℃孵育过夜。TBST洗涤5 min×6次后，山羊抗鼠二抗（1∶5 000）和山羊抗兔二抗（1∶10 000）室温摇晃孵育1 h，TBST洗涤5 min×6次。化学发光试剂盒（Thermo）A液和B液混合并覆盖于PVDF膜上，于凝胶成像系统采集数据，并进行后续灰度值分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS中文版22.0进行分析，满足正态性分布的数据以均数±标准差（±s）表示，多个样本均数的比较采用One-way ANOVA进行检验，两两比较采用 Dunnett′st检验和SNKq检验进行检验；计数资料组间比较采用行×列的卡方检验。相关分析据数据类型，采用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠前成骨细胞

MC3T3-E1的培养、ALP染色及钙盐沉积，见图1。成骨细胞合成、分泌ALP，当骨内沉积增加磷酸钙盐时，ALP的合成分泌也随之增加，因此ALP是成骨细胞开始向成熟骨细胞分化的重要标志。当成骨前体细胞进入细胞外的基质矿化期，表明细胞已进入成熟分化的后期，成骨细胞可将合成的碱性磷酸酶和钙盐结晶体分泌至细胞外基质中，与前期表达的胶原结合，这有助于提高细胞表面微环境的钙盐和磷的含量使基质矿化。茜素红染色液可将复合物染色（Ca2+与Alizarin Red鳌和呈桔红色，所以钙盐沉积检测是反映骨细胞成骨功能的另一个标志）。显微镜下观察，小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为柱状形、多边形，位于细胞质中部的细胞核较大，细胞生长活跃（图1A）。细胞ALP染色阳性（图1B），有钙盐沉积于细胞外基质（图1C），细胞成骨功能良好。

2.2 GST提高成骨相关基因的表达

RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN 基因都是成骨分化的指标，其表达水平能反映成骨细胞的分化程度。用 GST 干预 MC3T3-E1 细胞 7、14、21 d 后，Realtime PCR检测成骨相关因子RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN基因的表达，结果显示GST能使RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN基因的表达显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见图2。

2.3 GST促进Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达

图1 小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的培养、ALP染色及钙盐沉积检测

图2 GST作用于MC3T3-E1对成骨相关基因的影响

图3 GST作用于MC3T3-E1对WNT/β-catenin信号通路相关基因的影响

Wnt/β-catenin信号通路是成骨细胞最关键的信号通路之一，β-catenin、LRP5、GSK-3β 基因是Wnt/β-catenin信号通路中的相关基因。在GST干预 MC3T3-E1细胞7 d、14 d、21 d后用Realtime PCR检测Wnt/β-catenin信号通路相关基因（β-catenin、LRP5、GSK-3β）mRNA 表达，结果显示 GST 能显著提高 β-catenin、LRP5、GSK-3β基因的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见图3。

2.4 GST 能激活 MC3T3-E1

细胞的Wnt/β-catenin信号通路 qPCR结果显示GST能促进MC3T3-E1的Wnt/β-catenin信号通路相关基因 β-catenin、LRP5、GSK-3β 的表达，且呈时间依赖性，对照组在不同时间培养阶段则无明显差异。因此，选取对照组细胞培养21 d，用GST 干预 MC3T3-E1 细胞 7 d、14 d、21 d，βcatenin蛋白的表达在 7 d、14 d、21 d后明显高于对照组，且呈现连续上升的趋势。结果见图4。

图4 GST干预 MC3T3-E1细胞7 d、14 d和21 d后β-catenin蛋白的表达改变

3 讨论

谷胱甘肽是人体重要的抗氧化因子，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，含有巯基（-SH），广泛分布于机体各器官内，对于维持细胞生物功能有重要作用［4］。还原型谷胱甘肽（GST）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）构成人体最重要的抗氧化系统，GST作用于活性氧等氧化物质进而变成GSSG，减轻活性氧对细胞的毒害作用，GSSG经过还原作用又变成GST，如此周而复始，维持着细胞内的稳态。由此我们探究外源性补充GST而不加入活性氧的刺激对小鼠遗传背景的MC3T3-E1成骨细胞株是否依然有促进作用。

MC3T3-E1细胞系来源于小鼠颅盖骨细胞，是经典细胞模型，广泛用于成骨过程的体外实验研究。成骨细胞在骨形成过程中发挥着重要的作用，是成骨的主要细胞，负责骨基质的生成、分泌以及矿化。RUNX2是RUNT相关基因家族成员之一，在成骨细胞分化、软骨细胞成熟及骨基质蛋白的产生中发挥重要作用，对预防和治疗骨质疏松意义重大［5］。OSX是在骨组织的发育中表达的关键转录因子，是在RUNX2因子后又一被发现的成骨细胞分化的关键转录因子，它调控着许多重要的成骨基因［9］。COLⅠ基因是成骨分化的早期标志物，OCN基因是成骨晚期标志物，对成骨细胞的成熟有重要调节作用。因此我们主要检测RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN 这 4个主要的成骨标志物基因的表达情况。在GST干预MC3T3-E1细胞 7 d、14 d 和 21 d 后，RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN 4个基因在各个时间点都有不同程度的提高，且差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明 GST有明显促进MC3T3-E1向成骨细胞分化的作用。

近年来在骨代谢方面，以研究经典 Wnt/βcatenin信号通路对成骨细胞的影响为热点，经典Wnt信号对于成骨分化及骨生成有非常重要的作用。目前研究表明，调节任何一个经典Wnt/βcatenin信号转导通路中的因子都能影响成骨细胞的分化增殖［10］。因此，本实验我们检测Wnt/βcatenin信号通路相关基因β-catenin、LRP5、GSK-3β mRNA表达。β-catenin是Wnt信号通路最关键的因子，我们也检测β-catenin蛋白的表达作为验证。本研究从Wnt信号通路中经典通路Wnt/β-catenin的角度探讨其可能的作用机制，探讨GST对MC3T3-E1细胞的作用机制。在GST干预7 d、14 d 和 21 d 后，Wnt/β-catenin 信号通路相关基因 β-catenin、LRP5、GSK-3β mRNA 的表达明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。GST 不仅影响成骨相关基因的表达，同时也促进Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白β-catenin的表达，结果表明Wnt/β-catenin信号转导通路可能参与GST对MC3T3-E1细胞向成骨细胞方向分化的调控。

本研究以成骨细胞体外培养为模型，在未加活性氧处理情况下探讨单纯GST对成骨诱导条件下培养的MC3T3-E1细胞是否有促进成骨作用，探究在未加活性氧处理的MC3T3-E1细胞中，GST能否激活Wnt/β-catenin通路。观察GST对成骨细胞的影响，有助于我们进一步扩大抗氧化物对骨形成以及相关生物学作用机制的了解，为进一步深入研究骨生理过程中的抗氧化物调节分子转导机制奠定坚实基础，同时也可为其在骨折以及骨代谢疾病中的临床应用提供新的思路和实验依据。