紫苏籽油抗菌活性研究

王素君，张良晓，李培武，王秀嫔，张 奇

(1中国农业科学院油料作物研究所，武汉 430062；2农业部油料作物生物学与遗传改良重点实验室，武汉 430062；3农业部油料作物风险评估重点实验室(武汉)，武汉 430062；4农业部生物毒素检测重点实验室，武汉 430062；5农业部油料及制品质量监督检验测试中心，武汉 430062))

紫苏籽油抗菌活性研究

王素君1，2，张良晓1，3，5*，李培武1，3，4，5*，王秀嫔1，5，张 奇1，4，5

(1中国农业科学院油料作物研究所，武汉 430062；2农业部油料作物生物学与遗传改良重点实验室，武汉 430062；3农业部油料作物风险评估重点实验室(武汉)，武汉 430062；4农业部生物毒素检测重点实验室，武汉 430062；5农业部油料及制品质量监督检验测试中心，武汉 430062))

以革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌作为供试菌株，采用滤纸片法测定评估了紫苏籽油经过皂化提取之后其提取液抑制大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的能力，并将所得的结果与大豆油的抑菌作用进行比较。结果表明，紫苏籽油提取液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两个供试菌株的抑制效果较强，且对于枯草芽孢杆菌的抑制效果要优于大肠杆菌，且紫苏籽油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果要优于大豆油。

紫苏籽油；抗菌活性；大肠杆菌；草芽孢杆菌

紫苏(Perillafrutescens)含有丰富的营养成分和药用价值，是卫生部首批颁布的药食两用植物[1-3]，具有抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、抗菌[6]等功效。紫苏籽含油量达到40%～60%，紫苏籽油富含α-亚麻酸[7-9]，具有降血脂[10]、预防心血管疾病[11]、促进神经系统和大脑发育[12]、提高学习记忆、预防老年痴呆症[13]、抗肿瘤[14]等营养功能[15]。除富含α-亚麻酸外，紫苏籽油含有酚酸、植物甾醇、特质性挥发成分等活性成分。

油脂的抗菌活性越来越受到重视。埃及和德国联合研究发现冷榨孜然油具有抗菌作用[16]；西班牙圣地亚哥联合大学研究了初榨山茶油、橘籽油、茶梅籽油的甘油酯组成、抗氧化与抗菌活性，结果发现，三种初榨油脂均表现抗菌活性，其中山茶油对大肠杆菌的抑制效果最佳[17]。Gecgel等[18]分析比较了冷榨摩洛哥坚果油、石榴籽油、海枣籽油、亚麻籽油、红花籽油、黄金梅籽油、核桃油、葡萄籽油的水分及挥发物、折光指数、比重、碘值、皂化值、游离脂肪酸、酸价、色泽等理化指标，脂肪酸组成和对病原菌和产毒霉菌的抗菌活性，结果显示，冷榨石榴籽油和摩洛哥坚果油的抗菌活性最高，核桃油次之。冷榨红花油对病原菌S.enteridis ATCC 13076、冷榨石榴籽油对L.monocytogenes ATCC 7644的抑菌活性最好，而葡萄籽油对寄生曲霉NRRL 2999和NRRL 465的抑菌活性最好。近期研究发现，紫苏籽对口腔致龋链球菌、牙周牙龈卟啉单胞菌具有抑制作用[19]，能抑制去卵巢大鼠牙槽骨丢失[20]。对紫苏籽油的抑菌活性尚无报道。

本研究采用滤纸片扩散法，研究紫苏籽油对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抑菌活性，为进一步全面研究紫苏籽油中的有效抑菌成分及其抑菌作用提供技术支撑，为深入开展、挖掘紫苏籽油新产品的研究开发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1仪器设备 有机系滤膜(孔径0.22μm)；天平(感量0.000 1g)，德国Sartorius公司；KQ-300E超声仪，中国昆山仪器公司；HQ-60型混合涡旋混合器，北方同正生物技术发展公司。

1.1.2试剂 正己烷和乙醇均为色谱纯，购自安徽时联特种溶剂股份有限公司；KOH(优级纯)，购自国药集团化学试剂有限公司；氯化钠(分析纯)，购自中国国药集团化学试剂有限公司；酵母粉(Yeast extract)、蛋白胨(Tryptone)，均购自美国Fisher Scientific公司；超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm，25℃)。自榨紫苏籽油和大豆油由实验室采用太古家用榨油机(佛山太电智能科技有限公司)物理压榨制备。

1.1.3供试细菌 革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichiacoli)购买自武汉大学菌种保藏中心。

1.2 试验方法

1.2.1紫苏籽油提取液制备级 称取0.2 g(精确到0.005g)植物油于具塞玻璃试管中，加入6mL 2mol/L KOH乙醇溶液溶解，于液体混匀器上快速混匀1min。超声时间40 min，超声温度75℃，超声功率100%的条件下进行皂化，皂化结束后，3.5mL正己烷混匀，加超纯水至管口位置涡旋混匀后静置分层。取上层澄清层收集，重复3次，室温条件下氮气吹干，用35%的乙醇定容至0.5mL。

1.2.2细菌培养基的制备 胰蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、酵母提取物定容至1L纯净水中作为液体培养基，固体培养基则在液体培养基的基础上加入15.0g琼脂完全溶解后在121℃、0.15 MPa条件下高温高压灭菌30 min备用。

1.2.3菌株的活化及菌悬液的制备 在超净工作台上，将供试菌株用平板划线法接种在平板培养基上，待活化后挑取单克隆菌株，置于2 mL相适应的液体培养基中37 °C摇床恒温培养12h，使用平板计数法确定菌液稀释度后稀释至105～106 CFU/mL备后续的抑菌实验用。胰蛋白胨10.0 g、氯化钠5.0 g、酵母提取物定容至1L纯净水中作为液体培养基，固体培养基则在液体培养基的基础上加入15.0g琼脂完全溶解后在121℃、0.15 MPa条件下高温高压灭菌30 min备用。

1.2.4滤纸片紫苏籽油对受试菌株的抑菌作用

(1)使用打孔器对干净且吸水性较强的优质定性滤纸打孔为6 mm的圆形的滤纸片，并置于洁净干燥的玻璃培养皿中，在121°C的条件下高压蒸汽灭菌30 min，灭菌后置于无菌操作台上备用。

(2)于无菌操作台中将配好的不同菌种的菌悬液震荡摇匀后吸取100 μL均匀的菌悬液置于平板上，并使用灭菌的涂布棒均匀涂布在一次性倒好的冷却凝固的固体培养基表面上。用灭菌的镊子夹取浸泡含有不同精炼程度的食用植物油提取液的圆形滤纸片放到涂有菌悬液的平板培养基上，每个培养皿放5个纸片。其中，平板上放置无菌水空白对照在中间，提取溶剂对照观察。

(3)将处理好的细菌平板于37℃培养箱培养24h，到培养时间结束后取出，观察菌落的生长情况，用直尺测量抑菌圈的直径，为保证实验结果的准确性采用十字交叉方法，记录数据，每个实验的皂化提取液重复3次测定，最后计算的平均值转换为抑菌率评价抑菌效果。

实验中将抑菌率作为评价抗菌效果的指标，抑菌率的计算公式为式(1)：

(1)

1.3 统计分析法

所有的实验菌重复3次测定，所有结果以平均值来表示。使用SAS 9.5统计分析系统进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 提取液对各种供试菌株的抑菌效果

采用滤纸片法测定紫苏籽油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种供试菌株的体外抑菌活性研究，抑菌活性通过测定抑菌圈的直径换算抑菌率来表示，并将测定的结果与大豆油相比较。由表1和表2可见，紫苏籽油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种供试菌株的抑菌率菌均具有抑制作用，且紫苏籽油的抑菌效果要优于大豆油。

表1 紫苏籽油提取物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果

表2 大豆油提取物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果

2.2 紫苏籽油和大豆油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌抑制效果

为了更显著地反应紫苏籽油和大豆油的抑菌作用，进行T-test检验和方差分析。使用SAS 9.0软件中的T-test的检验分析表1和表2中的抑菌结果，检验紫苏籽油和大豆油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌抑制效果的显著性。由表3可以看出，紫苏籽油和大豆油对于大肠杆菌的抑菌效果差异不显著，而对于枯草芽孢杆菌的抑菌效果差异显著，且紫苏籽油的抑菌效果明显好于大豆油。

表3 紫苏籽油和大豆油抑菌显著性(T-test检验分析)

使用SAS软件中的一般线性模型(GLM)过程步骤对表1和表2中的抑菌率进行方差分析，以检验紫苏籽油和大豆油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌抑制效果的显著性(表4)。

表4 紫苏籽油和大豆油的抑菌显著性(方差分析)

注：因素A紫苏籽油和大豆油；因素B大肠杆菌和枯草芽孢杆菌

由表4可以看出，紫苏籽油和大豆油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果有极显著的差异(P<0.000 1)，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种供试菌株差异不显著(P=0.093 1>0.05)。由表3和表4得出紫苏籽油的抑菌效果要明显优于大豆油。

3 结论

本文测定了紫苏籽油皂化提取液对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑制作用以及其与大豆油提取液的对照结果。采用超声辅助皂化后的提取液革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌如大肠杆菌均有较明显的抑制作用，而大豆油提取液的抑菌效果则较差。总体抑菌效果比较，紫苏籽油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果要明显好于大豆油。紫苏作为一种食药两用的植物，研究其抑菌作用，发掘紫苏籽油营养功能潜力和优势，对综合利用和开发紫苏籽油新产品提供了必要的基础。◇

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Antibacterial Effects of Perilla Seed Oil Against Escherichia Coli and Bacillus Subtilis

WANG Su-jun1，2，ZHANG Liang-xiao1，3，5*，LI Pei-wu1，3，4，5*，WANG Xiu-pin1，5，ZHANG Qi1，4，5

(1Oil Crops Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430062，China；2Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops，Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China；3Key Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Oil Crops(Wuhan)，Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China；4Key Laboratory of Detection for Mycotoxins，Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China；5Quality Inspection and Test Center for Oilseed Products，Ministry of Agriculture，Wuhan 430062，China)

Taking gram negativeEscherichiacoliand the gram positive bacterium as tested strains，filter paper method was used to determine and evaluate antibacterial effects of the extract of Perilla seed oil againstEscherichiacoliandBacillussubtilis.Then，antibacterial effects of Perilla seed oil were compared with soybean oil.The results indicated that the extract of Perilla seed oil possessed strong antibacterial effects againstEscherichiacoliandBacillussubtilisthan soybean oil.Compared withEscherichiacoli，the extract of Perilla seed oil showed stronger antibacterial effects againstBacillussubtilis.

perilla seed oil；antibacterial effects；Escherichiacoli；Bacillussubtilis

国家农产品质量安全风险评估重大项目(项目编号：GJFP201701、GJFP201715-02)；农业部、财政部专项课题“国家油菜现代产业技术体系建设”(项目编号：CARS-13)；中央级科研院所基本科研业务费专项(项目编号：1610172017008)。

王素君(1988— )，女，硕士研究生，研究方向：农产品质量与食物安全。

*共同通信作者：张良晓(1981— )，男，博士，副研究员，硕士生导师，研究方向：农产品安全、化学计量学；李培武(1961— )，男，博士，研究员，博士生导师，研究方向：农产品质量安全标准与检测技术。

(责任编辑 唐建敏)