高效液相色谱法测定白酒中纽甜含量的不确定度评定

孙 洁，孙立臻，秦凤姣，汪灵巧，张 玮，高 兴

（山东景芝酒业股份有限公司，山东安丘262119）

高效液相色谱法测定白酒中纽甜含量的不确定度评定

孙 洁，孙立臻，秦凤姣，汪灵巧，张 玮，高 兴

（山东景芝酒业股份有限公司，山东安丘262119）

采用高效液相色谱法测定白酒中纽甜含量，并对其测定结果进行不确定度分析，建立了不确定度来源分析因果图和数学模型，通过计算各不确定度分量，得出纽甜的扩展不确定度，找出影响纽甜不确定度的主要因素并加以有效控制，该评定对提高白酒中纽甜检测结果的准确度具有重要意义。

高效液相色谱； 白酒； 纽甜； 不确定度

纽甜是功能性甜味剂，对白酒香气、口感有特殊的协调平衡作用。近几年来，有些酒类企业为了自身利益，用液态发酵酒加纽甜等甜味剂勾兑冒充纯粮酿造酒，对市场带来不正当竞争。为了保障我国传统纯粮酿造酒酿酒工艺得以延续，鼓励白酒生产企业提高并稳定产品质量，《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》GB 2760—2014规定白酒中不得添加甜味剂等任何非自身发酵物，即发酵酒中不得添加任何甜味剂，因此对白酒中纽甜含量的准确测定，将为企业白酒质量控制和相关监管部门规范市场行为提供重要依据。

测量不确定度是评定测量结果质量的一个重要指标。在分析检测工作中,由于种种原因,分析结果往往带有误差,而不能得到真值。为评价测定结果的质量,需要进行不确定度的评定。不确定度愈小,结果与真值愈近,数据愈准确。ISO/IEC 17025《检测和校准实验室能力的通用要求》指出，当检测结果处于产品标准要求的临界值，有可能判定产品不合格时，应给出测量不确定度。

根据GB/T 5009.247—2016《食品安全国家标准食品中纽甜的测定》原理，用高效液相色谱法测定白酒中纽甜的含量。根据CNAS—GL06《化学分析中不确定度的评估指南》、JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》规定的方法，建立了数学模型，对高效液相色谱法测定白酒中纽甜进行不确定度分析，同时在不确定度评定过程中，找出主要影响因素并加以有效控制，对提高白酒中纽甜检测结果的准确度具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

白酒样品：加入纽甜的白酒样品。

试剂：纽甜标准品(C20H30N2O5，纯度≥99.8%)，上海安谱公司；甲醇(CH3OH，色谱纯)，上海安谱公司；辛烷磺酸钠(C8H17NaO3S，色谱纯)，上海安谱公司；磷酸（H3PO4，优级纯），天津科密欧公司；甲酸（CH3COOH，色谱纯）；三乙胺（C6H15N，色谱纯），上海安谱公司。

仪器设备：高效液相色谱仪(1120 Compact LC)，美国安捷伦公司；电子分析天平(FA2004，感量0.0001 g)，上海上平仪器公司；超纯水系统(M illi-Q)，美国密理博公司；0.22 μm滤膜，有机系。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Aglient TC-C18(2)柱 ，5 μm，250 mm×4.6 mm；流动相：甲醇+离子对试剂缓冲液(70+30)；检测波长：218 nm；流速：0.8 mL/min；进样量：50 μL；柱温：30 ℃。

1.2.2 试剂的配制

混合提取液：分别吸取0.8 mL甲酸和2.5 mL三乙胺，加水定容至1000 mL，pH4.5。

离子对试剂缓冲液：称取2.00 g辛烷磺酸钠，用500 mL水溶解，加入1.0 mL磷酸，加水定容至1000 mL。

1.2.3 标准溶液的制备

标准储备液：准确称取0.1 g纽甜标准品，加混合提取液溶解定容至100 mL。标准工作液：分别吸取适量标准储备液用混合提取液配制成浓度分别为0.2 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L的系列标准工作液。

1.2.4 实验操作

准确称取10 g白酒样品(精确至0.0001 g)于25 mL离心管中，在40℃水浴中氮吹浓缩至微干，加2 mL混合提取液，振荡摇匀，再经0.22 μm微孔有机滤膜过滤待用，以外标法定量。

2 数学模型的建立和不确定度来源分析

2.1 数学模型

根据GB/T 5009.247—2016中测量结果的计算公式建立评定纽甜含量测量不确定度的数学模型。测量结果计算公式如下：

式中：X——样品中纽甜的含量，mg/kg；

C——样品中纽甜峰面积对应的浓度，mg/L；

V——样品定容总体积，mL；

F——回收率校正系数；

m——样品质量，g。

根据《化学分析中不确定度的评估指南》白酒中纽甜含量测定的相对标准不确定度为：

2.2 确定和分析测量不确定度的主要来源

由上述公式可知，纽甜含量测定的不确定度主要来源可归为以下几个方面：标准品称量、标准溶液的配制、标准工作曲线的拟合；样品的称量、定容体积、回收率等几个方面，见图1。

图1 纽甜测定主要不确定度来源因果图

3 不确定度分量评定

3.1 A类不确定度分析

取一白酒（无纽甜）样品，加入1.5 mg/L纽甜标准品，在同样条件下重复测定10次，测定结果见表1。

表1 n=10次独立重复测量的测量值

由贝塞尔公式得出10次测定的实验标准偏差的相对不确定度为：

3.2 B类不确定度分析评定

3.2.1 纽甜标准溶液配制引入的不确定度

标准物质不确定度包含标准物质的纯度、天平的称量和标准溶液配制引入的不确定度。

3.2.1.1 标准物质纯度P引入的不确定度UP

纽甜标准物质的纯度为99.8%，按矩形分布处理，则纯度引起的不确定度为：

3.2.1.2 天平称量引入的不确定度

根据电子天平检定证书，最大允许误差为±0.01 mg，m测量值落在该区间的概率分布为均匀分布，包含因子，其标准不确定度为：Um=

称取标准物质纽甜为0.0500 g，则相对标准不确定度为：

则标准物质合成相对标准不确定度为：

3.2.1.3 标准工作液配制过程中引入的不确定度

3.2.1.3.1 配制系列标准液过程中玻璃量具引入的不确定度

配制系列标准液过程中使用了A级1 mL、2 mL、5 mL移液管和A级50 mL、10 mL容量瓶。按照JJG 196—2006《常用玻璃器皿检定规程》都有相应的容量允差。欧洲分析化学中心（EURACHEM）认定其服从三角形分布，包含因子，则计算的标准不确定度见表2。

由表2数据合成的相对标准不确定度：

3.2.1.3.2 配制系列标准溶液过程中温度引入的不确定度

根据检定规程JJG 196—2006规定，检定是在室温20℃环境条件下进行的，实验室一般定容在20℃±5℃条件下进行。因为液体的膨胀系数远大于玻璃，因此，只需考虑前者即可。水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，按照矩形分布，则计算的不确定度见表3。

由表3数据合成的相对标准不确定度：

则标准溶液配制产生的不确定度：

表2 标准溶液配制中玻璃量具引起的不确定度

表3 标准溶液配制中温度引起的不确定度

3.2.1.3.3 标准曲线拟合引入的不确定度分量U拟合

标准曲线产生的不确定度来源于其残差的标准差，残差为测量值与标准曲线拟合之差的绝对值分别配制浓度为 0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL的标准工作液。进行测量后建立的标准曲线的回归方程及相关系数、纽甜的标准曲线测量值（x）、拟合值（）、拟合值（）以及所得残差（x-），结果见表4。

表4 标准曲线的测量值(x)和拟合值()和残差值(x-)以及回归方程和相关系数(r2)

表4 标准曲线的测量值(x)和拟合值()和残差值(x-)以及回归方程和相关系数(r2)

注：y=4.34518e-007，x+0.0552854，r2=0.999979。

484576 6062404 12076081 23926892 48115144 0.272 2.72 5.24 10.48 20.96 498747 6132576 11932105 23991445 48110123 14171 70172 143976 64553 5021

标准曲线的残差为：

由拟合引起的相对不确定度：

式中：b为斜率，N为测量标准溶液的总次数，P为测量样品的总次数。带入数据计算得到纽甜的拟和不确定度：

3.2.2 样品称量、定容的不确定度

3.2.2.1 样品称量的不确定度

被测样品质量的不确定度主要来源于天平的最大允许误差，标准不确定度为0.00577，样品称量10 g，则相对不确定度为：

3.2.2.2 样品定容的不确定度

样品在40℃水浴中氮吹浓缩至微干，加2 mL混合提取液，由2 mL移液管引入的不确定度。主要是移液管的容量允差和温度引起的不确定度，在表2和表3中已经计算，分别为U校准=0.002041；U温度=0.00061。

则V定容引起的不确定度：

3.2.2.3 回收率引起的不确定度

样品前处理不完全或造成纽甜的损失，通过对酒样（无纽甜）分别加入纽甜0.50 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L，对各浓度重复测定3次，计算加标回收率，见表5。

酒样(无纽甜)加标0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L，所得的回收率的标准相对偏差的平均值S=0.87%，则标准不确定度为相对不确定度为

3.3 相对不确定度各分量汇总

表5 酒样（无纽甜）加标，重复测定3次所得回收率

表6 相对标准不确定度分量

由表6中各相对不确定度合成样品中纽甜含量结果的相对标准不确定度为：

3.4 扩展不确定度

取置信概率P=95%，则k=2，计算扩展不确定度。

相对扩展不确定度 U=k×U（x）=2×0.0605=0.121 mg/L，由实验数据计算的平均值为1.5，扩展不确定度U=0.121×1.5=0.182 mg/kg≈0.2 mg/kg，因此高效液相色谱法测定白酒中纽甜含量X=（1.5±0.2）mg/kg；k=2。

3 结论

通过对白酒中纽甜含量的不确定度各个分量的分析与评定，得出该检测方法的扩展不确定度为0.2 mg/kg。由表6可以看出，标准溶液配制过程产生的相对不确定度分量对整个实验的相对不确定度贡献是最大的。因此，在实验中对该环节要格外关注，严格执行国家食品安全标准，使用计量检定合格的计量器具减少不确定度分量，对提高检测结果的准确性，规范食品添加剂在食品中的使用行为具有重要意义。

[1]杨君,王建华,刘靖靖,等.食品中甜味剂的检测技术研究进展[J].化学分析计量,2013,22(5)：100-103.

[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品中纽甜的测定：GB 5009.247—2016[S].北京：中国标准出版社,2016.

[3]全国食品工业标准化技术委员会酿酒分技术委员会.固液法白酒：GB/T 20822—2007[S].北京：中国标准出版社,2007.

[4]中国合格评定国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南：CNAS—GL06：2006[S].2006.

[5]全国法制计量管理计量技术委员会.测量不确定度评定与表示:JJF 1059.1—2012[S].北京：中国标准出版社,2013.

[6]全国流量容量计量技术委员会.常用玻璃量器鉴定规程：JJG 196—2006[S].北京：中国计量出版社,2007.

[7]陈俊,黄琼,万红梅,等.高效液相色谱法测定白酒中安赛蜜、糖精钠的不确定度分析[J].酿酒科技,2011(8)：179-182.

[8]林子吉,李霞,易啸,等.高效液相色谱法测定白酒中糖精钠含量的不确定度评定[J].酿酒科技,2011(8)：179-182.

[9]柯润辉,王丽娟,安红梅,等.超高液相色谱-串联质谱法直接测定白酒中8种甜味剂[J].酿酒科技,2016(5)：107-109.

[10]张莹,远辉,丁春瑞.超高效液相色谱法测定白酒中纽甜不确定度评定[J].酿酒科技,2016(12)：99-101.

Evaluation of the Uncertainties in the Determination of Neotame Content in Baijiu by HPLC

SUN Jie,SUN Lizhen,QIN Fengjiao,WANG Lingqiao,ZHANG Wei and GAO Xing
（Jingzhi Distillery Co.Ltd.,Anqiu,Shandong 262119,China）

The content of neotame in Baijiu was measured by HPLC,the uncertainty analysis of the measurement results was performed,and the cause-and-effect diagram and the mathematical model for analyzing the uncertainty source were set up.Each uncertainty component was calculated to obtain the expanding uncertainty,and the major factors influencing the uncertainties in the measurement were found out and they were effectively controlled.This evaluation had an important significance for improving the accuracy of measurement of neotame content in Baijiu.

HPLC;Baijiu;neotame;uncertainty

TS262.3；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2017）12-0078-05

10.13746/j.njkj.2017285

2017-11-03

孙洁（1966-），女，高级工程师，从事白酒质量分析工作20多年。

2017年1—10月中国白酒、啤酒产量

本刊讯：据《中国白酒网》和《中国国际啤酒网》报道，2017年10月，中国白酒行业产量118.7万千升，同比增长8.2%。2017年1—10月，中国白酒行业累计产量1048.6万千升，同比增长5.6%。2017年10月，中国啤酒行业产量292.5万千升，同比下降1.9%。2017年1—10月，中国啤酒行业累计产量3988.1万千升，同比增长0.2%。（江源荐，黄筱鹂编辑）

来源：中国白酒网 2017-11-16；中国国际啤酒网 2017-11-17