外源激素提高杜仲叶中有效成分含量的效果

魏艳秀 ，刘慧东 ，杜红岩 ，3，苗作云 ，孙志强 ，3，崔发喜

（1. 国家林业局 泡桐研究开发中心，河南 郑州 450003；2. 中国林科院 经济林研究开发中心，河南 郑州450003；3. 国家林业局 杜仲工程技术研究中心，河南 郑州 450003；4. 黄河科技学院，河南 郑州 450002；5. 河南省孟州国营林场，河南 孟州 454791）

外源激素提高杜仲叶中有效成分含量的效果

魏艳秀1，2，刘慧东1，2，杜红岩1，2，3，苗作云4，孙志强1，2，3，崔发喜5

（1. 国家林业局 泡桐研究开发中心，河南 郑州 450003；2. 中国林科院 经济林研究开发中心，河南 郑州450003；3. 国家林业局 杜仲工程技术研究中心，河南 郑州 450003；4. 黄河科技学院，河南 郑州 450002；5. 河南省孟州国营林场，河南 孟州 454791）

采用芸苔素内酯、DCPTA、DTA-6、赤霉素对杜仲叶片进行叶面喷施，以水处理为对照，测定分析4种不同的外源激素对杜仲叶中光合色素、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸积累的影响。结果表明：4种外源激素均可显著或极显著提高杜仲叶中光合色素和3种有效成分的含量，其中芸苔素内酯对促进桃叶珊瑚苷含量平均比对照增加61%以上，对京尼平苷酸的增效在41.13%～60.10%之间，但对绿原酸的合成没有积极效果；DCPTA对桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸的增效分别在46.52%～62.39%和48.27%～39.65%之间，但对绿原酸仅有1.25%～5.19%的增效；DTA-6对桃叶珊瑚苷含量比对照最高增加72.04%，京尼平苷酸最高增加接近1倍，为90.03%，绿原酸亦较对照最高增加了20.46%；赤霉素对绿原酸的增加率在所有参试激素中最高，为23.08%。总体上看，DTA-6在促进3种有效成分含量增加方面效果突出且表现稳定。在实际应用上，可以根据以有效成分种类为利用目标，有选择地使用不同的激素。

外源激素；杜仲叶；有效成分；光合色素

杜仲Eucommia ulmoidesOliver是我国特有的第四纪孑遗树种，也是我国传统的名贵药用植物[1-3]。杜仲的药用成分主要为木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类、松脂素二糖甙、绿原酸等次生代谢产物，其中关键的成分如松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、绿原酸和总黄酮等，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用[4-6]。过去上述次生代谢产物主要从树皮中提取，近年来大量研究表明杜仲叶与皮化学成分，特别是有效成分基本一致，而且其药理和作用效果相同[6-8]，中国药典2005版已将杜仲叶收录其中[9-10]。

目前，杜仲叶已被用于开发提取上述有效成分，例如京尼平苷、桃叶珊瑚苷、绿原酸等，用于生产杜仲药品、保健品、功能食品、饲料添加剂和化妆品等[7,11-12]，但整体产业化规模很小。杜仲叶中有效成分含量较低，如桃叶珊瑚苷、绿原酸等含量仅在1%～3%之间[8]，原材料供应不足是限制杜仲叶大规模工业加工的主要因素之一；其次，由于杜仲树体高大，杜仲叶的采集耗工费时，效率低下而成本高昂，成为限制杜仲叶规模化利用和开发的因素之二。例如，灵宝金地杜仲产业有限公司拟以杜仲叶为原料开发生产保健功能饮料，其公司自产的杜仲叶成本在3 200～3 500 元/t，其中人力成本占80%，其他的成本包括运输、贮藏和前期处理等费用（中国林科院经济林研究开发中心调查数据，2014）。

因此，创新杜仲栽培模式以降低杜仲叶采收成本以及提高杜仲次生代谢物含量是实现杜仲叶产业化开发利用的两个主要解决方案。杜仲“果园化栽培模式”初步解决了长期以来困扰杜仲果实利用的低产和高成本的问题[13-14]，但仍然未能有效降低杜仲叶片的采收效率和成本。目前许多国家和地区发展以收获地上部分生物量为目标的短周期作物林(short rotation coppice culture)[15-18]，采用密植技术并以1～3 a为采伐周期，产量不但大大提高，而且由于采用机械化收割，其采收成本也大大降低[19]。这种栽培模式对杜仲叶片产业化利用具有重要启发。

另一方面，如果能够找到简便有效的方法提高杜仲次生代谢物的含量，将有助于提高杜仲有效成分（包括绿原酸、京尼平苷、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、杜仲醇、杜仲胶等）的产量，进而降低生产成本。而在提高植物有效成分方面，化控技术是一种简便易行和成本低廉的解决手段。何广文等[20]利用ABT生根粉使杜仲叶中的京尼平苷酸在较长时间内增加超过9%。而张强[21]发现赤霉素使杜仲叶中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸等次生代谢物质的含量提高达15%～56%，且不受采样时间的影响 。但整体上，有关外源激素、特别是一些新型植物激素对杜仲叶中有效成分含量影响的系统研究较少。譬如，叔胺类活性物质的典型代表如DCPTA和 DTA-6，它们已被证明通过调节光合产物的分配来达到调节次生代谢物质的合成的作用，尤其是促进萜类化合物的生物合成，在银胶菊、柑橘、番茄、兰云杉、柚子等中均有所应用[22]。芸苔素内酯作为第六类植物激素，已在粮食、蔬菜、水果和药用植物等20多种作物上取得登记，其活性比其他五大类植物激素高出1 000倍，而且其安全性也得到证实[24-25]。上述激素均未见在杜仲上的应用报道。

为此，本研究通过建立杜仲短周期作物林栽培模式（有关对生物量的增效和收获成本将另文报道），采用芸苔素内酯、DCPTA、DTA-6等外源激素，并以清水为对照，研究4种激素促进杜仲叶中主要有效成分含量的效果，力图筛选出适宜的激素种类及其施用技术，为杜仲产业化发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验地位于中国林业科学研究院经济林研究开 发 中 心 孟 州 基 地（112°33′E，34°50′N）。 该基地南临黄河，属黄河滩地。大陆性暖温带季风型气候，年降水量约 549.9 mm，年平均气温 为14.3℃，无霜期 224 d，沙壤土，具有中部平原地区黄河古道沙地典型立地特征。

1.2 试验设计

供试材料为1 年生杜仲实生苗，2015年3月初采用宽窄行栽植，移植后平茬。栽植密度为0.2 m×0.5 m×1 m，即株距0.2 m，窄行距0.5 m，宽行距1 m。采用完全随机区组试验设计，4种激素分别为芸苔素内酯1%粉剂、2 - ( 3 ,4 -二氯苯氧基) -三乙基胺 ( DCPTA) 分析纯、己酸二乙氨基乙醇酯( DTA-6 )分析纯、赤霉素分析纯（均为郑州郑氏化工产品有限公司提供）。每种激素设3个质量浓度，每个质量浓度处理重复3次，每重复处理10株；设清水对照。激素质量浓度配置参见表1。

选择生长状况相对一致的杜仲苗，处理间设置保护行。2015年6月30日—7月2日每天上午8:00—10:00，采用叶面喷施，一周后重复喷施1次。于8月20日统一采样，在每个重复的每株苗木的中部各取2片叶供叶绿素和3种有效成分含量的测定。

表1 试验处理及代码Table 1 Coding of factors and levels

1.3 光合色素提取与含量的测定

采用Fadeel的方法[23]测定叶绿素和类胡萝卜素含量。称量剪去叶脉后的新鲜叶片0.1 g（精确到0.01 g），加入90%丙酮9 mL黑暗研磨后（4 000 r/min）离心10 min，然后取上清液采用紫外-可见分光光度计（Cary 300）分别测定445、644和662 nm处的吸光值，并计算叶绿素和类胡萝卜素的含量。

叶绿素a含量（mg/g）：

叶绿素b含量（mg/g）：

总叶绿素含量（mg/g）：

类胡萝卜素含量（mg/g）：

式中：A为在一定波长下的光密度；C为光合色素浓度；V为提取液体积；W为样品鲜质量。

1.4 有效成分提取和含量的测定

将采回的杜仲叶样品杀青3 min，于50℃真空干燥至恒质量，粉碎，过40目筛，每份样品精密称取1.0 g（精确到0.001 g）。置50 mL锥形瓶中，加入50%的甲醇溶液25 mL，然后置于数控超声波清洗器(HT-300BQ)中，频率40 kHz超声洗涤40 min后，放至室温，称定质量，用50%甲醇溶液补足失重后摇匀，过滤取滤液，用0.22 μm微孔滤膜过滤后即可进样测定。

桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸的测定采用改进HPLC法，以BDS hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，甲醇 (B)-0.5% 磷酸水溶液(A)为流动相，进行梯度洗脱（0 ～ 30 min，5% ～ 15% B；30 ～ 55 min，15% ～ 25%B）；检测波长为 206 nm（0 ～ 15 min）、236 nm（15 ～ 55 min）； 流 速 1.0 mL·min-1， 柱 温30℃，进样量为 7 μL。分别配制 0.72 、0.28 和0.56 mg·mL-1桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸标准品溶液，依次进样1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0和15.0 μL，计算峰面积。以对照品进样质量为横坐标（X），其峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸的回归方程分别为：Y=5.0×105X-2 666.0（R=0.999 3）；Y=2.2×106X-2779 2（R=0.999 8）；Y=2.0×106X-5144 0（R=0.999 9）。

1.5 数据处理及统计分析

分别采用单因素方差分析 (P＜0.05)检验不同处理后的叶绿素含量和各有效成分成分含量的差异性并进行Duncan多重比较。采用SPSS软件（20.0版）进行数据分析、采用Excel 2007作图。

2 结果与分析

2.1 外源激素对杜仲叶中光合色素含量的影响

不同处理间叶片内叶绿素a的含量差异极显著（F=9.00，p=0.00）（见表2）；多重比较结果显示，处理A2、C1、C3、D1之间无显著差异，但极显著高于对照和A3、B1、B2、D2等处理。同时，处理A1、B3、和D3亦显著高于对照，但整体上显著低于C3和D1，而与A2和C1间的差异不显著。A2、C1、C3、D1处理后叶绿素a含量分别比对照增加了25.78%、28.91%、39.84%和34.38%。而A3和B1处理后对叶绿素a有明显的抑制作用，分别比对照低1.56%和6.25% 。

叶绿素b含量在不同处理间差异极显著（F=3.06，p=0.00）；多重比较结果显示，处理A1、C1、C2、 D1极显著高于对照、B1、B2、D3，而与A2和C3间的差异不显著，比较发现处理A2对叶绿素b的促进作用最为明显，比对照增加52.17%，而处理B1和B2对叶绿素b的促进作用最小，仅比对照增加了4.35%（见表2）。

经4种不同的激素处理后，叶绿素的含量差异极显著（F=6.53，p=0.00），多重比较结果显示，处理A2、C1、C2、C3、D1之间无显著差异，但极显著高于对照、A3、B1、B2、D2、D3等处理。同时，处理A1、B3亦高于对照，但整体上显著低于C3（见表2）。5 mg/L的芸苔素内酯，20 、60 、100 mg/L DTA-6，100 mg/L赤霉素处理后叶绿素含量分别比对照增加了32.76%、31.03%、27.59%、38.51%和35.06%。而B1处理对叶绿素有明显的抑制作用，含量仅为1.68 mg/g，比对照低3.45%。

类胡萝卜素含量在不同处理间差异极显著（F=8.33，p=0.00）（见表2），多重比较结果显示，处理C3含量达到0.58 mg/g，比对照高38.10%，极显著高于A3、B1、B2和D2。同时A1、A2、B3、C1、 C2、D1、D3之间无显著差异，但均显著高于对照而低于处理C3（见表2）。A2、C2、D1、D3处理后类胡萝卜素含量分别比对照增加了14.29%、16.67%、21.43%和11.90%，而A3和B1处理对类胡萝卜素有明显的抑制作用，比对照低2.38%。

2.2 外源激素对杜仲叶中桃叶珊瑚苷含量的影响

4种外源激素处理后均显著提高了杜仲叶中桃叶珊瑚苷含量（见图1）。芸苔素内酯不同处理的桃叶珊瑚苷含量极显著高于对照（F=11.29，p=0.00），多重比较显示处理A1、A2、A3间无显著差异，桃叶珊瑚苷的含量平均比对照增加63.77%，最高为66.65%（见图1）。

DCPTA处理后，各处理间的差异极显著（F=10.91，p=0.00），多重比较表明处理B1、B2、B3间无显著差异，但均显著高于对照（见图1），桃叶珊瑚苷含量随着激素浓度的升高表现为先降后升，B1、B2和B3处理后桃叶珊瑚苷含量比对照分别增加了62.39%、46.52%和55.82%。

表2 不同激素处理对各光合色素含量的影响†Table 2 Effects of different concentration hormones on the contents of photosynthetic pigment

图1 不同激素处理对桃叶珊瑚苷含量的影响Fig.1 Effects of different concentration hormones on the contents of aucubin

喷施DTA-6后，不同处理间桃叶珊瑚苷含量存在极显著差异（F=9.08，p=0.00），多重比较显示C3显著高于C1，而与C2间无差异，且C1和C2间无显著差异（见图1）。随着质量浓度升高，DTA-6各处理的桃叶珊瑚苷的含量表现为C3＞C2＞C1＞CK，其中C3处理比对照提高72.04%。赤霉素处理后，不同处理间的差异极显著（F=5.61，p=0.00），多重比较显示D1、D2和D3之间无显著差异但均显著高于对照（见图1）。桃叶珊瑚苷的含量提高了37.10%～61.70%，其中处理D1使桃叶珊瑚苷的含量达到25.69 mg/g，比对照高61.70%，低浓度的促进作用更为明显。

综合比较发现，100 mg/L的 DTA-6对桃叶珊瑚苷的促进作用最为明显，喷施后桃叶珊瑚苷的含量达到27.34 mg/g，比对照（15.89 mg/g）提高72.04%；其次，5 mg/L芸苔素内酯使桃叶珊瑚苷的含量提高66.65%；100 mg/L的DCPTA 处理后比对照增加了62.39%，而100 mg/L赤霉素使桃叶珊瑚苷的含量达到25.69 mg/g，比对照高61.70%。

2.3 外源激素对杜仲叶中京尼平苷酸含量的影响

4种外源激素处理后均显著提高了杜仲叶中京尼平苷酸含量（见图2）。芸苔素内酯不同处理的京尼平苷酸含量差异显著（F=4.04，p=0.01），多重比较显示处理A1、A2和A3间无显著差异但均显著高于对照（见图2），京尼平苷酸的含量最高较对照增加60.10%，其增加效果表现为A2＞A1＞A3＞CK。

图2 不同质量浓度激素对京尼平苷酸含量的影响Fig. 2 Effects of different concentration hormones on the contents of geniposidic acid

DCPTA处理杜仲叶片后京尼平苷酸含量差异显著（F=4.46，p=0.01），多重比较显示虽然B1、B2、B3间无显著差异，但B2与对照间差异亦不显著（见图2），其中京尼平苷酸含量最高较对照增加39.65%，低质量浓度的效果较好，表现为B1＞B3＞B2＞CK。DTA-6各处理的京尼平苷酸的含量差异极显著（F=6.19，p=0.00），多重比较显示C1、C2与C3间无显著差异均显著高于对照（见图2），随着质量浓度的升高，其中C2处理后京尼平苷酸的含量达到7.24 mg/g，比对照高90.03%，作用效果表现为C2＞C3＞C1＞CK。杜仲叶经赤霉素处理后，各处理间无显著差异（F=1.30，p=0.30），其中京尼平苷酸含量最高，较对照增加49.42%，含量随着质量浓度的增加先升后降，表现为D2＞D1＞D3＞CK。

综合比较发现，60 mg/L的DTA-6对京尼平苷酸的促进作用最为明显，喷施后京尼平苷酸的含量达到7.24 mg/g，比对照高90.03%；芸苔素内酯的质量浓度为5 mg/L时使京尼平苷酸的含量最高，较对照增加60.10%；赤霉素质量浓度为300 mg/L时使京尼平苷酸的含量达到5.69 mg/g，比对照高49.42%；而DCPTA 质量浓度为100 mg/L，比对照仅增加了39.65%。

2.4 外源激素对杜仲叶中绿原酸含量的影响

4种外源激素对绿原酸含量的影响程度较小，变化幅度为20.29～26.63 mg/g（见图3）。芸苔素内酯不同处理的绿原酸含量无显著差异（F=0.98，p=0.42），较低或较高的芸苔素内酯浓度对绿原酸合成有抑制作用，A1于A3处理比对照分别低6.23%和2.66%，而中度质量浓度的芸苔素内酯则可提高绿原酸的含量，A2比对照高0.49%。

图3 不同质量浓度激素对绿原酸含量的影响Fig. 3 Effects of different concentration hormones on the contents of chlorogenic acid

DCPTA处理的杜仲叶片绿原酸含量间无显著差异（F=0.411，p=0.75），绿原酸含量比对照提高了1.25%～5.19%，高质量浓度的效果较好，表现为B3＞B2＞B1＞CK。DTA-6不同处理的绿原酸含量差异极显著（F=14.90，p=0.00），多重比较显示C2与C3无显著差异，但均与C1和CK存在显著差异（见图3），绿原酸的含量最高，较对照增加20.46%，随着质量浓度的升高，绿原酸含量表现为C3＞C2＞C1＞CK。喷施赤霉素后，各处理间绿原酸含量存在极显著差异（F=7.33，p=0.00）（见图3），多重比较显示D2和D3存在显著差异并且均显著高于D1和CK，绿原酸含量随着浓度的升高表现为先升后将，处理D1、D2和D3比对照分别高7.30%、23.06%和12.29%。

综合比较发现，300 mg/L的赤霉素对绿原酸的促进作用最为明显，喷施后绿原酸的含量达到26.63 mg/g，比对照21.64 mg/g高23.08%；其次，100 mg/L的DTA-6 处理比对照增加了20.46%，而芸苔素内酯和DCPTA的作用效果不明显。

3 结论与讨论

2-(3,4- 二氯苯氧基)- 三乙基胺( DCPTA) 和己酸二乙氨基乙醇酯（DTA- 6）是叔胺类物质的典型代表，是一类调节植物光合作用、具有生物活性和低分子量特性的化合物。叔胺类物质能够促进净光合速率、光合产物代谢及分配, 能够促进萜类化合物的生物合成，协调营养生长和生殖生长[22]。例如，DCPTA 处理后，菠菜叶肉细胞的叶绿体横切面比对照增加了25 % ～40%，叶绿体类囊体的体积和基质的含量增加，显著提高了每克鲜叶和单位面积叶绿素含量[26]。 DTA- 6 处理甜菊叶片后，甜菊糖苷总含量在14 d 时比对照提高了38%，而且丽鲍迪苷（R- A）占丽鲍迪苷（R-A）和甜菊苷（SS）的总含量达71%，比对照提高1 倍以上[27]。而芸苔素内酯是以甾醇为骨架的具有植物生长调节作用的生物活性物质，不同于其他激素，它对植物的各个生长发育时期都能发挥调节作用。芸苔素内酯可以提高叶绿素的含量，加强光合作用，促进生长发育[25]。

本研究结果表明，喷施芸苔素内酯、DTA-6、DCPTA和赤霉素后，杜仲叶中光合色素含量均显著增加。A2、C1、C3、D1处理后叶绿素a含量分别比对照增加了25.78%、28.91%、39.84%和34.38%。处理A2对叶绿素b的促进作用最为明显，比对照增加52.17%，而处理B1和B2对叶绿素b的促进作用最小，仅比对照增加了4.35%。5 mg/L的芸苔素内酯，20 mg/L、60 mg/L、100 mg/L DTA-6、100 mg/L赤霉素处理后叶绿素含量分别比对照增加了32.76%、31.03%、27.59%、38.51%和35.06%。处理C3类胡萝卜素含量达到0.58 mg/g，比对照高38.10%。

综合比较各激素处理后杜仲叶中3中活性成分的变化，发现芸苔素内酯对促进桃叶珊瑚苷效果稳定，均比对照增加61%以上，对京尼平苷酸的增效在41.13%～60.10%之间，但对绿原酸的合成没有积极效果甚至抑制绿原酸的合成；DCPTA对3中活性成分均有较好的增效效果，除对绿原酸有1.25%～5.19%的增效外，其他2中活性成分的增加率总体上均低于芸苔素内酯的增量效果；DTA-6的总体效果最为稳定，其中，桃叶珊瑚苷最高增加72.04%，京尼平苷酸最高增加90.03%，接近1倍，而绿原酸亦较对照最高增加了20.46%。赤霉素的表现也很稳定，其突出表现是绿原酸的增加率在所有参试激素中最高，为23.08%，但对桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸的增量上没有芸苔素内酯和DTA-6表现突出，但整体结果与张强等相符[21]。综述所述，在实际应用上，可以根据以有效成分种类为利用目标，对不同激素合理使用。总体上看，DTA-6在促进3种有效成分含量增加方面效果突出且表现稳定，可以重点关注。

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Efficacy of exogenous hormones enhancing active ingredients inEucommia ulmoidesleaves

WEI Yanxiu1,2, LIU Huidong1,2, DU Hongyan1,2,3, MIAO Zuoyun4, SUN Zhiqiang1,2,3, CUI Faxi5
(1. Paulownia R& D Center of China, Chinese Academy of Forestry CAF, Zhengzhou 450003, Henan, China; 2. Non-timber Forest R&D Center, CAF, Zhengzhou 450003, Henan, China; 3. Eucommia Engineering Research Center of State Forestry Administration, Zhengzhou 450003, Henan,China; 4. Huanghe Science and Technology College, Zhengzhou 450003, Henan, China;5. Henan Mengzhou State Forest Farm, Mengzhou 454791, Henan, China)

The effects of four different exogenous hormones, i.e. brassinolide, DCPTA, DTA -6, gibberellin, on contents of photosynthetic pigment, aucubin, geniposidic acid and chlorogenic acid inEucommia ulmoidesleaves were measured and analyzed based on the experiments of spraying leaves with different dilutions and taking water treatment as control. The results indicated that the content of photosynthetic pigment and three active ingredients inEucommia ulmoidesleaves were increased statistically significant by all of the four exogenous hormones compared with control treatment. Brassinolide increased the aucubin content by more than 61% and enhanced geniposidic acid ranging from 41.13% to 60.10% than that of control, while it had no positive effect on synthesis of chlorogenic acid.DCPTA increased the aucubin and geniposidic acid contents by 46.52%～62.39% and 48.27%～62.39%, while chlorogenic acid content was increased only by 1.25%～5.19%, respectively. Aucubin, geniposidic acid and chlorogenic acid in leaves treated by DTA-6 were increased by 72.04%, 90.03%, and 20.46% respectively compared to control treatment. Among the four hormones, Gibberellin enhanced chlorogenic acid by 23.08% than that of control treatment, which was the highest among all treatment. These hormones could be used in practice according to the objectives of ingredients utilizations. Overall, DTA-6 was the most effective hormone in enhancing the active ingredients inEucommia ulmoidesleaves and it should be taken into account in the future practical applications.

exogenous hormones;Eucommia ulmoidesleaves; active ingredients; photosynthetic pigment

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.05.008 http: //qks.csuft.edu.cn

2015-12-21

“十二五”农村领域国家科技计划项目（2012BAD21B0502）

魏艳秀，硕士研究生

孙志强，研究员；E-mail：sun371@ 163.com

魏艳秀，刘慧东，杜红岩，等. 外源激素提高杜仲叶中有效成分含量的效果[J].中南林业科技大学学报，2017,37(5):42-49.

S718.43

A

1673-923X(2017)05-0042-08

[本文编校：谢荣秀]