多花黄精组培体系建立及薯蓣皂苷等含量测定

刘芳源， 王 钰， 开桂青， 谢 枫

(1. 安徽大学 资源与环境工程学院， 合肥 230601； 2. 安徽大学 生命科学学院， 合肥 230601)

多花黄精组培体系建立及薯蓣皂苷等含量测定

刘芳源1， 王 钰1， 开桂青2， 谢 枫1

(1. 安徽大学 资源与环境工程学院， 合肥 230601； 2. 安徽大学 生命科学学院， 合肥 230601)

为了加快繁殖多花黄精，建立多花黄精组培体系，对组培快繁培养基配方等进行研究，并利用UPLC法测定多花黄精中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的含量。结果显示，最适快繁培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IAA，炼苗最适基质为泥炭土+沙子(2∶1)，多花黄精中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元总含量范围为90.49～174.42 μg/g。

多花黄精；组织培养；薯蓣皂苷；薯蓣皂苷元；UPLC

多花黄精(PolygonatumsibiricumHua)，隶属百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)，为中国传统大宗药材[1]。多花黄精性平、味甘，具有滋阴润燥、补肾益精、降血脂、降血糖、降血压、提高人体免疫力、抗衰老、抗肿瘤等功效[2-6]，为滋补上品。多花黄精是药食同源不可多得的植物，具有很好的开发与应用价值。然而由于种子发芽率低、育苗周期长，多花黄精无法满足市场需求。与传统栽培方式相比，组织培养具有不受季节制约、繁殖系数较高的优点，可在短期内大规模繁殖性状稳定的优良种苗[7]。因此，本文通过建立多花黄精组织培养体系，以期为多花黄精快繁、开发利用和种质改良提供参考。

多花黄精中的甾体皂苷主要有薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元[8-9]，具有降血糖、抗肿瘤、抗HIV的生物活性[10-11]。甾体皂苷被认为是黄精的主要有效成分之一[4]，但2005 版《中国药典》中仅以葡萄糖的含量作为控制黄精药材质量的指标，专属性、实用性差，不能准确可靠地控制药材黄精的质量。为更好地利用黄精资源，控制黄精药材的质量，本文采用UPLC法同时测定多花黄精中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的含量。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用安徽多花黄精采摘于安徽省池州市九华山境内，贵州、湖北、河南产地多花黄精根茎购于亳州药材市场。

1.2 主要仪器与试剂

苏州净化SW-CJ-ID型超净工作台，Acquity UPLC 色谱仪系统(包括四元溶剂管理器、自动进样器、PDA检测器、Waters Acquity UPLC色谱柱、Waters Empower 色谱工作站，美国Waters公司)，SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，旋转蒸发器RE52-99(上海亚荣生化仪器厂)。

氯化高汞(HgCl2)、无水乙醇、甲醇、乙腈、琼脂、蔗糖、6-苄基氨基酸腺嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、吲哚-3-乙酸(IAA)，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 组织培养

1)培养条件。光照强度为2000 Lx，光周期为16 h /d，培养温度为(24±2) ℃。基础培养基MS，含有30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂，pH 5.8～6.0。实验所用培养基均经121℃，蒸汽灭菌20 min。

2)种子萌发。取安徽野生多花黄精种子，冲洗干净后用75%的乙醇漂洗20 s，无菌水冲洗2次，0.1% 升汞溶液消毒5 min，无菌水冲洗4～5次，接种MS培养基中，接种后放培养室培养观察，统计发芽率。

3)快繁培养基优化。以MS为基础培养基，选用L9(33)进行正交试验(表1)，添加IAA、NAA和6-BA 3种激素，将各长势相同多花黄精块状茎接种到培养基中，每组接种20瓶，每瓶接种3棵，培养30 d，每3 d观察并记录多花黄精芽增殖数。多花黄精芽增殖平均数=萌发不定芽总数/接种外植体数

表1 正交试验因素水平

4)炼苗移栽。组培苗长至5 cm左右，根4～6条时，将组培苗放置于无菌环境下开瓶，用镊子将苗从培养瓶中取出，用大量清水冲洗附在根部的培养基，分别移栽至蛭石+珍珠岩+松木屑(1∶1∶1)、泥炭土+蛭石+珍珠岩(1∶1∶1)、泥炭土+沙子(2∶1) 的基质中，每天对苗进行喷雾。炼苗28 d移栽到土壤中，土壤取自校园树林距地表20 cm处，统计移栽存活率。

1.3.2 野生植株及组培苗中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元含量测定

1)标准品溶液制备。精密称取薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元对照品各20.0 mg置于烧杯中，加甲醇溶解，加入到20 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得1.0 mg/mL对照品的母液。

2)供试品溶液制备。组培苗(培养60 d)根茎和野生植株根茎放置在烘箱中，于50 ℃下烘至恒重，然后用研钵研磨成精细粉末，过80目筛。准确称取1.00 g粉末，置锥形瓶内，精密加入质量分数75%乙醇10 mL，冷浸12 h，超声处理2 h，过滤，滤液加正丁醇萃取，静置24 h，取正丁醇相烘干，残渣用5 mL甲醇溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品。

3)UPLC色谱条件。Waters Acquity UPLC C18色谱柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)，流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0～2 min，45% A；2～5 min，45%～85% A；5～14 min，85%～100% A；14～17 min，100%～45%A)，检测波长203 nm，体积流量0.3 mL/min，柱温28℃，进样量5 μL。

4)线性关系考察。分别精密吸取对照品母液2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL，置于5 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成0.40、0.60、0.80、1.00和1.20 mg/mL对照品溶液。取制备好的系列浓度的标准溶液，按UPLC色谱条件进样，以对照品峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，计算回归方程。

5)含量测定。取对照品和供试品溶液，按UPLC 色谱条件进行测定，并计算供试品中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的含量。

2 结果与分析

2.1 野生多花黄精种子萌发

野生多花黄精种子萌发周期较长，萌发率极低。本实验直接处理黄精种子，接种到MS培养基中，发芽率为27.6%，发芽周期为45 d。

2.2 不同植物生长调节剂对多花黄精芽增殖的影响

将各长势相同多花黄精块状茎接入继代增殖培养基一周后，开始有新芽出现，随后培养基中新芽进行繁殖，30 d 后统计繁殖系数，结果见表2。

由表3方差分析所得结果可知：IAA、NAA、6-BA各水平间的P<0.01，均有极显著性差异。由结果可知，筛选出的多花黄精最适培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IAA，在此培养基中生长的黄精芽增殖系数较高，达到3.2，并且长势良好，未添加任何激素的培养基中的黄精芽没有增殖。

2.3 炼苗移栽

在培养基中培养60 d左右的组培苗根系较为发达。炼苗移栽采用了3种基质，蛭石+珍珠岩+松木屑(1∶1∶1)的基质中，多花黄精存活率为53.3%，泥炭土+蛭石+珍珠岩(1∶1∶1)的基质中，存活率为66.7%，泥炭土+沙子(2∶1)的基质中，存活率为80%。泥炭土+沙子(2∶1)为较优的炼苗基质。炼苗28 d后移栽到土壤中。

表2 正交试验设计结果

表3 方差分析结果

A：R2=1.000(调整R2=0.998)

2.4 野生植株及组培苗中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元含量测定

2.4.1 线性关系考察

以对照品浓度X(mg/mL) 对色谱峰面积Y进行线性回归分析，得薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元回归方程分别为Y=5.9×105X+792(R2=0.9996)和Y=1.0×106X-36 609(R2=0.9996)，结果表明薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元浓度在0.40～1.20 mg/mL范围内线性关系良好。

图1 多花黄精各时期生长情况

A：萌发的芽； B：丛生芽； C：组培移栽苗(7 d)； D：组培移栽苗(60 d)

2.4.2 精密度实验

精密吸取对照品溶液，连续进样6次，按照UPLC色谱条件测得薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元峰面积的RSD分别为0.68%和0.82%，表明仪器的精密度良好。

2.4.3 稳定性实验

取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0、4、8、16、24和48 h后在UPLC色谱条件下测定。计算薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元峰面积的RSD分别为2.2%和1.6%，结果表明供试品溶液中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元在48 h内基本保持稳定。

2.4.4 重复性实验

每种黄精称取6份样品，每份各1.00 g，按1.3.2中方法制备供试品溶液，在UPLC色谱条件下分析测定，求得各样品中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的浓度，计算得各黄精的RSD分别为：薯蓣皂苷0.97%，薯蓣皂苷元2.03%，结果表明此方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率实验

称取已知含量的安徽黄精粉末6份，每份为1.00 g，分别加入薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元对照品适量，按1.3.2中方法制备供试品溶液，在UPLC色谱条件下测定，计算回收率，分别为99.48%和99.63%，RSD分别为1.71%和0.81%。

2.4.6 不同供试品中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元含量测定

湖北、贵州、河南、安徽产地多花黄精和组培苗各称取6份样品，按1.3.2中方法制备供试品溶液，在UPLC色谱条件下测定，并计算薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的平均含量，结果见表4。

通过实验结果对比发现组培苗和不同产地的野生植株中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的含量都存在差异，薯蓣皂苷变化范围为38.28～90.36 μg/g，薯蓣皂苷元变化范围为52.21～87.95 μg/g。薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元总含量从高到低的顺序为：安徽>组培苗>贵州>湖北>河南，所检测的成分在组培块状茎中的总含量较安徽野生植株低，这与李莺等研究结果一致[12]，不同产地间含量的差异与赵欣等研究结果一致[13]。

表4 样品测定结果

图2薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元混合对照品(A)和供试品(B)的UPLC图

Fig 2 UPLC of yam saponins and diosgenin mixed reference substances(A) and samples(B)

1：薯蓣皂苷；2：薯蓣皂苷元；a：湖北；b:贵州；c:河南；d:安徽;e:组培苗

3 讨论

利用黄精种子育苗，建立组培体系较易获得成功。直接从田间取样的多花黄精外植体用于组培，接种后会出现内生菌[14]。选用种子培养，播种在MS培养基中，出苗后再进行试管苗培养，可以避免自然环境中杂菌的感染，较易建立多花黄精组培体系。

薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元是黄精中的主要皂苷类成分，测定薯蓣皂苷元和薯蓣皂苷的含量，对控制生物制药和制剂的质量非常有必要。现有文献对于药材质量控制大多只涉及薯蓣皂苷元1种成分，皂苷元的获得须经水解、萃取、调节pH等步骤，操作烦琐，收率不稳定，易产生副反应，而对薯蓣皂苷含量测定鲜有报道。本研究所建立的超高效液相色谱测定方法不但能够同时反映薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的真实含量，而且操作简单快速、灵敏度高。

实验结果(表4和图2)显示安徽薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元总量较其他3个产地含量高，与前人研究结果一致[15]，造成这种结果的原因可能是：黄精生长喜阴喜湿，安徽九华山雨水较多，土壤湿润，适宜黄精生长。组培苗中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元总含量比野生植株的低，但组培苗具有繁殖率高、生长速度快的优点，方便实行工业化生产，为薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的制备提供原料。

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EstablishmentoftissueculturesystemanddeterminationofyamsaponinsanddiosgenininPolygonatumsibiricumHua

LIU Fang-yuan1, WANG Yu1, KAI Gui-qing2, XIE Feng1

(1. School of Resources and Environmental Engineering; 2. School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230601, China)

In order to accelerate the reproduction ofPolygonatumsibiricumHua, the paper established the tissue culture system ofPolygonatumsibiricumHua and studied the rapid propagation of tissue culture medium. The UPLC method was used for the determination of yam saponins and diosgenin inPolygonatumsibiricumHua. The results showed that the optimal medium was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IAA. The optimal medium for hardening was peat soil and sand(2∶1). The total content of yam saponins and diosgenin was in the range of 90.49-174.42 μg/g.

PolygonatumsibiricumHua; tissue culture; yam saponins; diosgenin; UPLC

2016-10-24；

2016-11-09

安徽大学研究生学术创新研究项目(YQH100245)

刘芳源，硕士，研究方向为种植资源保护与利用，E-mail:liufy522@163.com

王 钰，教授，博士，研究方向为种植资源保护与利用，E-mail: 03136@ahu.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.093

Q946.83

B

2095-1736(2017)06-0093-04