生物染色法在犬复孔绦虫虫种形态学鉴别中的应用

邢维媚，张锐，杨丽侨，张彩虹，殷慧敏，李丽花，芦亚君

(海南医学院热带医学与检验医学院1、基础医学与生命科学学院2，海南 海口 571199)

生物染色法在犬复孔绦虫虫种形态学鉴别中的应用

邢维媚1，张锐1，杨丽侨2，张彩虹1，殷慧敏1，李丽花1，芦亚君1

(海南医学院热带医学与检验医学院1、基础医学与生命科学学院2，海南 海口 571199)

目的调查海口市犬肠道内寄生虫——犬复孔绦虫的流行情况，并研究不同生物染色剂对犬复孔绦虫虫体的染色效果，确定最佳染色方法作为虫种形态学鉴别依据。方法使用正交试验设计法，选择醋酸卡红、齐尔石碳酸复红、德氏苏木素、孔雀绿及盐酸卡红五种不同的生物染色剂对虫体节片在不同时间、不同浓度分别染色，并对这五种生物染色剂两两组合进行复合染色，光学显微镜下观察形态结构并鉴别虫种。二甲苯透明法和冬青油透明法处理虫体节片，和染色法进行效果比较。结果20%醋酸卡红染色12 h、24 h和10%醋酸卡红染色24 h时染色成节效果更佳；齐尔石碳酸复红染液在48 h、72 h染色成节效果最佳；德氏苏木素染液在8～20 h时染色孕节效果最佳；4%的孔雀绿在6 h时染色孕节效果最佳；盐酸卡红在4～8 h时染色孕节效果最佳；复合染色时石碳酸首染，孔雀绿复染效果最佳。透明法处理孕节片效果佳。结论选择合适染色剂及确定最佳染色方案，可清晰观察到绦虫节片的形态结构，有利于虫种鉴别和病原学诊断。

犬复孔绦虫；流行；染色

犬复孔绦虫(Dipylidium caninum Linnaeus，1758)是一种犬、猫常见寄生虫[1]，成虫偶尔寄生于人体引起犬复孔绦虫病[2]。人常因误食含似囊尾蚴的病蚤而感染。该虫流行广泛，在很多国家和地区均有散在的病例报道[3-5]，我国也有数例报道，分散于北京、辽宁、山西等地[6]。人感染犬复孔绦虫后，表现为食欲不振、消化不良、腹痛、腹泻、烦躁不安等症状[6-9]，给人类健康尤其是儿童的身心健康带来极大危害。

犬复孔绦虫的病原学诊断主要依靠在粪便中查到虫体，并根据其典型的形态结构确定虫种。生物染色法能提供犬复孔绦虫虫体各节片最直观的鉴别依据。若染色效果不佳，则难于做确诊的依据。本文选择常见生物学染料，对犬复孔绦虫各节片进行染色效果评价，探索最佳染色效果的染色方法，便于对绦虫虫种的形态学鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 于海南省海口市某狗肉店取犬小肠，洗脱犬肠道获取全部绦虫。

1.1.2 试剂 苏木素精、冬青油、铵明矾、甘油、甲醇、浓盐酸、浓氨水、二甲苯、无水乙醇、中性树胶购于西陇化工股份有限公司；卡红购于西亚试剂；孔雀绿购于天津市天新精细化工开发公司；齐尔石碳酸复红染液购于福建厦门海标科技有限公司。

1.2 染色法

1.2.1 醋酸卡红染色法 配制5%、10%、15%和20%的醋酸卡红染液。经5%福尔马林固定的节片，分别于蒸馏水、30%酒精、50%酒精中漂洗30 min，在70%酒精中固定2～48 h，放于5%～20%醋酸卡红染液中6～24 h，2%盐酸酒精以分色和不分色两种方法处理标本，再放入70%、80%、90%、95%、100%、100%梯度酒精中20 min，二甲苯至透明，中性树胶封片[10]。按照染液的不同浓度、不同染色时间及是否分色三个要素进行如下实验设计(表1)。

表1 不同染色时间对绦虫节片染色效果比较

1.2.2 齐尔石碳酸复红染色法 经5%福尔马林固定的节片，分别放入蒸馏水、30%酒精、50%酒精中漂洗30 min，在70%酒精中固定8 h，使用齐尔石碳酸复红染液染色24～120 h，2%盐酸酒精以分色和不分色两种方法处理标本，再放入80%、90%、95%、100%、100%梯度酒精中20 min，二甲苯至透明，中性树胶封片[11]。按照染液的不同染色时间及是否分色两个要素进行如下实验设计(表2)。

表2 不同染色时间及是否分色对绦虫成虫成节的染色效果比较

1.2.3 德氏苏木素染色法 经福尔马林固定的节片，分别放入蒸馏水、30%酒精、50%酒精中漂洗30 min，在70%酒精中固定2～48 h；放入70%、50%、30%的酒精中30 min，蒸馏水10 min，放入稀释了15倍的德氏苏木素染液中8～20 h，蒸馏水冲洗3次，30%、50%、70%酒精中20 min，2%盐酸酒精以分色和不分色两种方法处理标本，再放入80%、90%、95%、100%、100%梯度酒精中20 min，二甲苯至透明，中性树胶封片[12]。按照染液的不同染色时间及是否分色两个要素进行如下实验设计(表3)。

表3 不同染色时间对绦虫成虫成节的染色效果比较

1.2.4 孔雀绿染色法(孕节) 配置2%、4%、6%、8%孔雀绿溶液。经5%福尔马林固定的节片，分别放入蒸馏水、30%酒精、50%酒精中漂洗30 min，在70%酒精中固定2～48 h；放入70%、50%、30%的酒精中30 min，蒸馏水10 min，放入染液中1～6 h，蒸馏水洗去虫体表面的浮色，2%盐酸酒精以分色和不分色两种方法处理标本，再放入30%、50%、70%，80%、90%、95%、100%、100%梯度酒精中20 min，二甲苯至透明，中性树胶封片[13-15]。按照染液的不同浓度、不同染色时间及是否分色三个要素进行如下实验设计(表4)。

表4 不同浓度及染色时间对绦虫成虫孕节的染色效果比较

1.2.5 盐酸卡红染色法 配置2%盐酸卡红染剂。经5%福尔马林固定的节片，分别放入蒸馏水、30%、50%酒精中30 min，在70%酒精中固定2～48 h；70%酒精30 min，盐酸卡红溶液染色4～16 h，70%酒精冲洗染液2～3次30 min，2%盐酸酒精以分色和不分色两种方法处理标本，放入80%、90%酒精2 h，95%酒精30 min、15 min，100%酒精10 min、5 min，二甲苯至透明，中性树胶封片[16]。按照染液的不同染色时间及是否分色两个要素进行如下实验设计(表5)。

1.2.6 复合染色法 绦虫可能会与两种不同染料结合而使其染色效果明显。因此，在筛选染液的最佳条件后，使两种不同染液结合染色，即第一种染液染完后并除去表面浮色，接着染第二种染液，加入第二种染液时间段设计为：5 s、30 s、1 min、3 min、5 min，按照正交试验设计法使染液两两进行复合染色，实验设计如下(表6)。

表5 盐酸卡红染色在不同时间下的染色效果比较

表6 不同染液复合染色效果比较

1.3 孕节片透明法

1.3.1 二甲苯透明法 经福尔马林固定的节片，放入蒸馏水2次，30%、50%酒精中30 min，在70%酒精中固定2～48 h；再按70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精中20 min，二甲苯至透明，中性树胶封片。

1.3.2 冬青油透明法 自保存液中取出，放入3:1的石碳酸与95%酒精溶液中至节片完全透明后，放入冬青油中15 min，中性树胶封片。

2 结 果

2.1 犬复孔绦虫流行病学调查 在18条狗的肠道内获取1 021条犬复孔绦虫，1条阔节裂头绦虫。

2.2 染色法

2.2.1 醋酸卡红染色 20%醋酸卡红染色12 h、24 h和10%醋酸卡红染色24 h，在分色情况下对犬绦虫的成节染色效果更佳，标本内部的结构清晰，卵巢的分叶及睾丸的个数及生殖孔位置都易于观察(图1)。20%醋酸卡红染色6 h，在分色情况下对犬绦虫头节染色效果更佳，能清楚的看到吸盘、顶突及小钩(图2)。

2.2.2 齐尔石碳酸复红染色 齐尔石碳酸复红染液染色48 h、72 h，在分色情况下对犬绦虫的成节染色清楚，标本透亮，结构清晰可辨，卵巢的分叶及睾丸的个数及生殖孔位置都易于观察(图3)。

图1 犬复孔绦虫成节(10%醋酸卡红染色24 h)10×2倍镜观察

图2 犬复孔绦虫头节(20%醋酸卡红染色6 h)10×20倍镜观察

图3 犬复孔绦虫成节(齐尔石碳酸复红染色48 h)10×2倍镜观察

2.2.3 德氏苏木素染色法 德氏苏木素染色法染色时间8～20 h在分色情况下染色孕节效果良好。能观察到孕节片标本中有数量不一的储卵囊，囊中能细数卵细胞的个数(图4)。

图4 犬复孔绦虫孕节(德氏苏木素染色12 h)10×2倍镜观察

2.2.4 孔雀绿 4%的孔雀绿在6 h不分色情况下染色孕节效果最佳，都能观察到孕节片标本中有数量不一的储卵囊，囊中能细数卵细胞的个数。而且耗时相对较少(图5)。

图5 犬复孔绦虫孕节(4%孔雀绿染色6h)10×2倍镜观察

2.2.5 盐酸卡红 盐酸卡红染色时间4～8 h在分色情况下染色孕节效果最佳，着色均匀，易于观察，节片结构清晰，储卵囊明显，卵细胞颗粒尽数(图6)。

2.2.6 复合染色法 复合染色法石碳酸首染，孔雀绿复染效果最佳，能看到孕节片清晰透亮，并有储卵囊，内有卵细胞(图7)。

图6 犬复孔绦虫孕节(盐酸卡红染色8 h)10×2倍镜观察

图7 犬复孔绦虫孕节(石碳酸首染，孔雀绿复染)10×2倍镜观察

2.3 透明法

2.3.1 二甲苯透明法 透明法用来制作孕节片效果佳，结构清晰，节片中的储卵囊清晰可见，内有卵细胞，而且耗材少(图8)。

图8 犬复孔绦虫孕节(二甲苯透明法)10×2倍镜观察

2.3.2 冬青油透明法 冬青油透明法用来制作孕节片效果佳，结构清晰节片中的储卵囊清晰可见，内有卵细胞，而且相对染色法较简单、省时(图9)。

图9 犬复孔绦虫孕节(冬青油透明法)10×2倍镜观察

3 讨 论

犬绦虫头节有无顶突和小钩、成节的子宫位置及分叶情况和睾丸数量的多少、孕节是否有储卵囊及囊中卵细胞数量的多少或子宫分支情况等是犬绦虫虫种鉴别的重要依据。因此制作结构清晰、易于观察的永久玻片标本是犬绦虫虫种鉴定的前提保证，本文图中结果是犬复孔绦虫[6，17]。绦虫染色过程很复杂，一份绦虫染色标本是由染液和被染标本发生复杂的物理和化学反应，才能使其各个组织结构染上了不同的色彩[18]。在制作标本过程中，染色时间的长短、染液浓度、是否分色和分色程度[19]及脱水过程的控制等对标本的顺利完成起着举足轻重的作用，缺一不可；绦虫背腹的厚薄程度也决定染液的浓度及染色时间，需据绦虫的大小及厚薄等来设计时间及染液浓度。

绦虫的形态学染色方法操作简单，易掌握，适用于临床、科研及教学，值得推广。

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Application of biological staining method in morphological identification of Dipylidium caninum.

XING Wei-mei1,ZHANG Rui1,YANG Li-qiao2,ZHANG Cai-hong1,YIN Hui-min1,LI Li-hua1,LU Ya-jun1.School of Tropical and Laboratory1,School of Basic Medicine and Life Science2,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the prevalence of canine intestinal parasites,Dipylidium caninum,in Haikou.The staining effects of different biological stains on Dipylidium caninum was studied and the best staining method was determined as the basis of morphologic identification.MethodsThe orthogonal design was used to design an experimental matrix to study the staining effects of five different biological stains(such as acetate carmine,carbol fuchsin,delafields hematoxylin,malachite green and hydrochloride carmine)on different parts of the body,at different time and different concentrations.Moreover,these five biological stains were combined in pairwise to stain specimens.The morphological structure was observed and identified under optical microscope,compared with Xylene transparent method and Holly oil transparent method to process proglottids.ResultsThe staining effects of mature proglottids were better when specimens were treated by 20%acetate carmine for 12 h,24 h,10%acetate carmine for 24 h and carbol fuchsin for 48 h,72 h.The best staining effects of gravid proglottids were observed when they were stained with delafields hematoxylin for 8～20 h,4%malachite green for 6 h and hydrochloride carmine for 4～8 h.If using combined staining method,the best staining result was obtained from carbol fuchsin-malachite green pairwise staining method.Optimal staining method for gravid proglottid is transparent method.ConclusionChoosing the suitable staining agent and optimal staining method is helpful to clearly observe the structures of tapeworms and is useful for species identification and pathogen diagnosis.

Dipylidium caninum;Prevalence;Staining

R383.3

A

1003—6350（2017）22—3691—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.22.025

国家级大学生创新创业训练计划项目（编号：201611810074）；海南医学院大学生创新创业训练计划项目（编号：HYCX2015019）

芦亚君。E-mail：luyajuncc@163.com

2017-04-11)