兔膝骨性关节炎模型关节液中IL-1、IL-6及TNF-ɑ水平的影响研究

黄飞麒 陈燕梅 赵 晓 姚乃捷 陈扬生 林 展

(广东药科大学附属第一医院正骨科，广东 广州 510080)

兔膝骨性关节炎模型关节液中IL-1、IL-6及TNF-ɑ水平的影响研究

黄飞麒 陈燕梅 赵 晓 姚乃捷 陈扬生 林 展

(广东药科大学附属第一医院正骨科，广东 广州 510080)

目的 探究兔膝骨性关节炎模型中盐酸氨基葡萄糖对IL-1、IL-6及TNF-ɑ浓度的影响。方法 选择成年雄性兔20只，分为OTL组(A组)与对照组(B组)各10只。两组分别制备膝骨性关节炎模型，B组按常规饮食，A组于制模成功后每日喂食盐酸氨基葡萄糖。收集两组右膝关节液检测其中IL-1、IL-6及TNF-ɑ水平。结果 A组与B组治疗前各项炎性因子水平对比，差异均不显著(P>0.05)。经治疗后A组膝关节液中炎性因子测定浓度均降低，对比可知统计意义显著(P<0.05)。结论 OTL可抑制兔膝关节液中IL-1、IL-6及TNF-ɑ的含量升高，进而缓解骨性病变与关节损伤。

膝骨性关节炎；IL-1；IL-6；TNF-ɑ

膝骨性关节炎(KOA)为退行性骨关节病变，中老年人群多发。该病早期表现为反复关节肿胀，病情进展可出现关节畸形或功能丧失。KOA不同发病期病理表现存在差异，与免疫因素、伤口等均存在关系。对于KOA的发病机理尚不明确，但是证实与炎性因子有关[1]。其中在KOA发病中发挥关键介导作用的因子中，被发现的有白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ)等。KOA早期多采用药物作为主要治疗方式，而中期需辅助手术。非甾体抗炎药为早期常用药，能够对PGE生成进行抑制，达到缓解疼痛、消炎的目的，但是长期服用存在副反应。盐酸氨基葡萄糖(OTL)被西方作为KOA的常规治疗药物，但是在我国的应用却存在一些争议。本次研究拟构建兔膝骨性关节炎模型，探究OTL对关节液中IL-1、IL-6、TNF-ɑ浓度的作用机制，现将实验及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验材料

选择20只月龄在3.2～4.3月之间的健康雄性成年大白兔，体重1.9～2.4 kg。实验试剂：盐酸氨基葡萄糖(240 mg/粒)、兔IL-1、IL-6与TNF-ɑ试剂盒。实验仪器包括酶标仪、离心机、Na2S以及相关手术器械。

1.2方法

1.2.1分组与制模 随机分为A、B两组，各为10只。应用硫化钠将所有兔右膝部位的毛脱去，经耳缘静脉注射浓度为3%的麻醉药物，绑敷于手术台上，依据Hulth法制备KOA模型。沿兔髌骨正中线切开约3 cm，露出股四头肌与髌骨韧带，将髌骨外翻，牵拉屈曲露出半月板，切开交叉韧带去除半月板。制模术中避免损伤周围软骨、神经与血管。抽屉实验检查呈阳性，则可清洗缝合切口。制模手术后抽取右膝关节冲洗液待测，并在术后三天内给予抗感染治疗。术后B组给予标准兔饲料定时喂养，A组于术后第二天在常规饮食的基础上给予适量OTL(80 mg/kg)，连续喂食两个月。于伤口愈合后每日两次驱赶实验兔行走，每次至少30 min。

1.2.2IL-1、IL-6、TNF-ɑ水平测定 喂养两个月后将所有实验兔通过空气栓塞处死，将胫腓骨至股骨下三分之一骨端切除，修正右膝关节周围组织，维持关节囊不受损，于髌上关节囊切开约0.5 cm，将1 ml蒸馏水注入右膝关节中，屈曲活动右膝关节，待混合均匀后抽取关节液约5 ml置入试管中。后离心，转速4500 r/min。取上层液置入冰柜内保存待用。采用酶联免疫吸附法，依据试剂盒说明分别测定各种炎性因子的含量。方法：于酶标板上设置十个标准孔，加入样品进行稀释，混合均匀。预留空白孔、待测孔，将稀释液加入标准孔中稀释至五倍。于温育箱中设置37 ℃培育30 min，使用稀释洗涤液对样品进行洗涤，反复五次。后加入酶标测试剂，重复以上步骤。每个孔中分别加入显色剂，轻微震荡摇匀，加入适量终止液，待颜色变化停止。以空白孔为基准，以波长为500 nm测定每孔中液体的OD值，绘制相应的坐标曲线，进而测定样品中炎性因子的浓度。

1.3统计学分析

2 结 果

2.1A、B两组右膝关节液中治疗前各项炎性因子含量对比

制模成功后两组均测出IL-1、IL-6与TNF-ɑ，提示与骨性关节炎进展存在关系。A组与B组各项炎性因子测定水平比较，差异均不显著(P>0.05)。见表1。

表1 A、B两组实验前各项炎性因子水平比较

2.2A、B两组治疗后右膝关节液中IL-1、IL-6与TNF-ɑ含量对比

经过两个月喂养给药，A组关节液中IL-1、IL-6与TNF-ɑ测定水平，与B组比较各项均下降明显(P<0.05)。见表2。

表2 A、B两组治疗后各项炎性因子水平比较

3 讨 论

3.1KOA模型可行性分析

KOA模型的制备是分析KOA病理学因素的辅助工具，在探究治疗法方面也发挥着关键作用。兔膝关节解剖结构与人体类似，故选用。实验中切断兔膝关节内侧半月板、交叉韧带，导致膝关节稳定性丧失，下肢无法对抗正常应力，加之缺少缓冲保护，很容易加重关节损伤。且兔KOA模型的各项生化指标与人体基本一致，故依据Hulth法开展实验是可行的。此外，试验中全部选择雄性兔，排除了性激素对结果的干扰。实验中通过肉眼观察，均提示模型制备成功。

3.2IL-1、IL-6、TNF-ɑ在KOA中的作用

KOA发病机制复杂，多认为存在力学、生化因素共同作用，导致膝软骨细胞降解失衡有关。研究表明，KOA中各类炎性因子发挥的作用不可小觑[2]。其中部分蛋白质因子能够促使膝软骨细胞外基质代谢失衡，进而导致膝关节发生退行性改变，如IL-1、TNF-ɑ等。在膝软骨修复期，关节液中IL-1、IL-6、TNF-ɑ等水平与炎症程度存在正相关性[3]。提示其与膝软骨的损伤存在相关性，且IL-1、IL-6与TNF-ɑ之间具备促进性[4]。膝关节软骨的组成包括软骨细胞与大部分基质，其中基质中富含胶原纤维，在软骨抵抗张力、传导应力方面发挥的作用十分显著，且可维持正常的细胞形态。IL-1可诱导膝软骨细胞生成NO，加快细胞凋亡速度，并产生参与炎性反应的PGE2[5]。IL-1也可与TNF-ɑ协同诱导血浆酶原生成，进而改变外基质结构，加重骨质炎症反应。IL-6在软骨病变全程中均存在，且可加快基质、纤维细胞降解，进一步破坏膝软骨[6]。

3.3将OTL应用于KOA中的机理

当前KOA早期治疗药物的作用分为两类，即改善炎症与延缓病情。前者包括糖皮质激素等，短期应用能够有效缓解病痛，但副作用明显[7]。后者主要为氨基葡糖糖等，口服后可生成酸根离子与游离葡萄糖，并在血液循环的作用下进入不同组织中。这类药物作用于KOA的机制一是延缓软骨被破坏，二是促进基质合成。OTL进入人体后可扩散至软骨细胞中，和促进蛋白多糖生成，进而与软骨基质作用形成弹性结构，发挥抵抗关节应力、避免骨质受损的作用。同时OTL可激活IL-1受体，使其与IL-1相互抑制竞争，破坏IL-1的调控机制。实验表明，OTL分解生成的酸根离子，也可为骨细胞营养生成创造条件，进而调控细胞蛋白多糖的合成。KOA引发的副作用小，胃部不适的发病率不到4.5%。部分研究也表明，其对于人体糖代谢、胰岛素代谢未造成影响[8]。

本次实验表明，OTL对于延缓KOA病情有一定的效果，对关节液中IL-1、IL-6及TNF-ɑ的生成存在抑制作用，为临床治疗提供了重要依据。

[1] 武敏,黄传兵.骨关节炎的中医药治疗研究进展[J].世界中西医结合杂志,2013,8(9):964-966.

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[4] 卢敏,谢心军,左亚杰,等.伤速康贴膏对兔膝骨性关节炎模型关节液中IL-1、IL-6及TNF-ɑ水平的影响[J].湖南中医药大学学报,2011,31(7):18-21.

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[8] 周荣魁,陈昌红,李贺,等.口服骨碎补总黄酮治疗膝骨关节炎患者的临床观察[J].中国医药导报,2011,8(2):77-78.

The rabbit model of knee osteoarthritis in the joint fluid, IL-6 and IL-1 the level of TNF-ɑ impact study

HUANGFei-qiCHENYan-meiZHAOXiaoYAONai-jieCHENYang-shengLINZhan

(Dept.of Orthopedics,First Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Guangzhou 510080,China)

Objective:Glucosamine hydrochloride on the rabbit model of knee osteoarthritis in the joint fluid, IL-6 and IL-1 the influence of the level of TNF-ɑ.Methods:Select 20 adult white rabbit, divided into OTL group (group A) and control group (group B) 10. Preparation of knee osteoarthritis models respectively in both groups, group B according to the normal diet, after the success of the group A in moulding the daily feeding glucosamine hydrochloride, two months after the contrast analysis of two groups of bilateral knee joint X-ray images.Collect were measured in two groups of right knee joint fluid, IL-6 and IL-1 level of TNF-ɑ.Results:Group A and group B before treatment of various inflammatory factors level comparison, no significant difference (P>0.05).After treatment group A decrease in the determination of inflammatory factor in knee joint fluid level, contrast there were significant differences(P<0.05).Conclusion:OTL inhibits the rabbit knee joint fluid, IL-6 and IL-1 the content of TNF-ɑ rise, thereby alleviating the bony lesions and joint damage.

knee osteoarthritis;IL-1;IL-6;TNF-ɑ

建设中医药强省立项资助科研课题(No:20151271)。

黄飞麒(1980—)，男，副主任中医师，在读博士，主要从事中医骨伤科方面的研究。

R684

A

1004-7115(2017)12-1364-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.014

2017-10-09)