一株四叶参内生真菌抑菌和抗氧化活性研究

张雅婧 黄巧丽 王 楠 张 娜 崔 萌 刘振亮 孙立彦

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

一株四叶参内生真菌抑菌和抗氧化活性研究

张雅婧 黄巧丽 王 楠 张 娜 崔 萌 刘振亮 孙立彦

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

目的 研究一株四叶参内生真菌SYG6的抑菌和抗氧化活性。方法 采用滤纸片法测定四叶参内生真菌SYG6抑菌活性，采用铁氰化钾还原力法和DPPH 法测定其抗氧化活性。结果 在供试菌株中，SYG6 仅对鳗弧菌有抑菌作用，抑菌圈直径为(6.500±0.017)mm。在测试浓度0～6.0 mg/ml范围内，SYG6还原力与浓度呈明显量效关系，其EC50值为1.6575 mg/ml；在1.5～6.0 mg/ml范围内SYG6对DPPH自由基清除率随浓度增大而增大，其IC50值为4.5895 mg/ml。结论 四叶参内生真菌SYG6具有一定抑菌和抗氧化活性，是筛选天然生物活性成分的潜在资源。

四叶参；内生真菌；抑菌和抗氧化活性

四叶参Codonopsis lanceolata (Sieb. et Zucc.) Trautv.为桔梗科党参属多年生缠绕性草本植物[1]，又名羊乳、山胡萝卜、羊奶参、轮叶党参，以根入药。泰安当地俗称泰山四叶参，为泰山四大名药之一[2]。四叶参为药食两用植物，在民间采其春季幼苗或根作山珍食用，美味可口，是难得的上好佳肴。传统上其根入药，具有清热解毒、止咳祛痰、补虚通乳、健身补气等功效，用于肺痈咳嗽、病后虚弱、产后缺乳等症，与泰山何首乌、黄精、紫草一道被称为“泰山四大名药”[3]。

植物内生真菌是植物生活史中的部分或全部阶段生活在植物组织内，但不造成明显病害症状的一类真菌，其代谢产物丰富，是新型药物的潜在资源[4]。关于四叶参内生真菌仅见徐旭等对四叶参内生真菌SYY1的报道[5]，本研究对从四叶参根中分离到的一株SYG6抑菌和抗氧化活性进行研究，为四叶参的利用及其野生资源的保护提供依据。

1 材料和方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料 四叶参内生真菌 SYG6乙酸乙酯粗提物；鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白色念珠菌 SU5314、白色念珠菌 YEM30(白色念珠菌由泰山医学院赵莹老师提供，其他菌株由山东师范大学王海英老师提供)。

1.1.2试剂 DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，Sigma公司)；BHT(2，6-二叔丁基对甲苯酚，国药集团化学试剂有限公司)；Vc(中国药品生物制品检验所)；铁氰化钾(天津市博迪化工有限公司)；磷酸氢二钠(天津市博迪化工有限公司)；磷酸二氢钠(天津市博迪化工有限公司)；MH 肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司)；沙堡氏琼脂(北京奥博星生物技术有限公司)；琼脂粉(天津市承大化学试剂研发中心)；等。

1.1.3主要仪器 SW-CG-RF超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；MJX-320多段编程霉菌培养箱，宁波市科技园区新江南仪器有限公司； UV-2550紫外分光光度计，岛津制作所；202-2AB电热恒温干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；LDZX-40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；FC-104电子分析天平，上海恒平科学仪器有限公司；XSP-2C生物显微镜，重庆光学仪器厂；XB-K-25血细胞计数板，玉环县求精医用仪器厂；等。

1.2试验方法

1.2.1样品粗提物的制备 制备SYG6种子发酵液(25 ℃，150 rpm，3 d)，在大米固体培养基上25 ℃发酵培养28 d，用乙酸乙酯浸提后真空浓缩得其粗提物，用于抑菌和抗氧化实验研究。

1.2.2抑菌活性试验

1.2.2.1供试菌株

表1 供试菌株

1.2.2.2培养基的制作

MH肉汤液体培养基：27.0 g肉汤，1 L蒸馏水，121 ℃灭菌25 min。

MH 肉汤固体培养基：27.0 g肉汤， 16.0 g琼脂，1 L纯水，在121 ℃下灭菌25 min。

沙堡氏培养基：67.0 g肉汤，1 L纯水，在121 ℃下灭菌25 min。

1.2.2.3抑菌活性测定[5-6]

将新鲜配置的培养基于121 ℃下灭菌，当培养基冷至50～60 ℃时，倒入灭菌的培养皿中，待平板冷却后，每皿中加入300 μl菌悬液(106～108个/ml)，用三角玻璃涂棒均匀涂成薄板。无菌镊子夹取已风干的无菌滤纸片(直径6 mm，20 mg/ml的样品甲醇溶液充分浸泡3 h)放在含菌平板上，每皿放3 片，倒置，37 ℃培养24 h，用游标卡尺测抑菌圈直径，测3次，取平均值。

1.2.3抗氧化性试验

1.2.3.1铁氰化钾还原力试验 参照文献[5-6]方法进行测定，精确移取1 ml不同甲醇浓度(6 mg/ml，3 mg/ml，1.5 mg/ml，0.75 mg/ml，0.375 mg/ml，0.1875 mg/ml，0.09375 mg/ml)的样品溶液于10 ml试管中，分别依次加入2.5 ml磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.6)，2.5 ml铁氰化钾溶液(10 g/L)，混匀，50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷却至室温，再加入2.5 ml三氯乙酸(100 g/L)，混匀，离心(3000 r/min)10 min，取上清液2.5 ml，加2.5 ml超纯水，0.5 ml三氯化铁(1 g/L)，混匀，室温反应10 min，700 nm测吸光度。用Vc和BHT作阳性对照，用1 ml甲醇代替样品溶液作空白对照。所有测定平行3次，取平均值。

1.2.3.2DPPH 自由基清除率试验 参照文献[5][7]方法进行测定，吸取0.5 ml不同甲醇浓度(6 mg/ml，3 mg/ml，1.5 mg/ml，0.75 mg/ml，0.375 mg/ml，0.1875 mg/ml，0.0938 mg/ml)的SYG6样品溶液，加入3.5 mlDPPH溶液(0.04 mg/ml，无水乙醇为溶剂)，混匀，25 ℃水浴黑暗反应30 min，静置10 min，取上清液，测定517 nm吸光度As。另取0.5 ml样品溶剂代替样品溶液同上操作，测定吸光度A0。另取0.5 ml不同浓度的样品溶液于试管中，分别加入无水乙醇3.5 ml，同上操作，测定吸光度Ab。以Vc、BHT作阳性对照，平行测定三次，取平均值，以自由基清除率E表示。E(%) =[Ao-( As-Ab) ]/Ao×100%。

2 结果与讨论

2.1抑菌活性的测定

依据1.2.2方法得到四叶参内生真菌SYG6 对5种供试菌株的抑菌圈直径，结果见表2。在供试菌株范围内，SYG6仅对鳗弧菌有抑菌作用，其抑菌圈直径为(6.500±0.017) mm，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白色念珠菌均无抑菌作用。

表2 SYG6 对供试菌株的抑菌圈直径/mm

2.2抗氧化活性实验

2.2.1铁氰化钾还原力的测定 根据1.2.3.1方法，测定不同浓度SYG6样品和阳性对照品(Vc、BHT)在700 nm 处的吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，得到SYG6和阳性对照品还原力曲线，结果见图1。从图1可见，Vc在0～6.0 mg/ml范围内，其吸光值随浓度增大不断增大；BHT在 0～1.5 mg/ml 范围内，其吸光值随浓度增大不断增大，而在1.5～6.0 mg/ml范围内，BHT吸光值略有下降趋势；SYG6在0～6.0 mg/ml范围内，其吸光值与浓度呈一定量效关系，在最高浓度6.0 mg/ml时，吸光值最大，还原力最强，但在相同浓度下，其还原力弱于阳性对照Vc和BHT。

图1 SYG6 、Vc和BHT还原力曲线

依据图1，在有效浓度范围内，建立浓度C与吸光度A线性关系，得线性回归方程，计算EC50(A 为 0.5 时的样品浓度)，结果见表3。

表3 SYG6 、Vc和BHT 还原力线性方程及其EC50 值

2.2.2DPPH 自由基清除率 根据1.2.3.2方法，得到不同浓度SYG6和阳性对照品对DPPH自由基的清除率E，以浓度C为横坐标，自由基清除率E为纵坐标，得到 SYG6和阳性对照对DPPH自由基的清除效果曲线，结果见图2。从图2可见，在1.5～6.0 mg/ml范围内，SYG6对DPPH自由基清除率随浓度的增大而增强。在0.0117～0.0469 mg/ml范围内，Vc对DPPH自由基清除率随浓度的增大而增强，在0.0469 mg/ml后基本趋于稳定。在0.0117～0.3750 mg/ml范围内，BHT对DPPH自由基清除率随浓度的增大而增强，在0.3750 mg/ml后BHT对DPPH自由基清除率基本趋于稳定。阳性对照Vc和BHT对 DPPH 自由基清除率均能达到80%以上。可见，SYG6对DPPH自由基有一定清除效果，但弱于Vc和BHT对DPPH自由基的清除效果。

图2 SYG6、Vc和BHT对DPPH自由基清除能力曲线

依据图2，在有效浓度范围内，建立浓度C与自由基清除率E线性关系，得回归方程，计算 IC50(E为50% 时的浓度)，结果见表3。

表3 SYG6、Vc和BHT 清除DPPH线性方程及IC50值

3 结 论

本实验用滤纸片法测定四叶参内生真菌SYG6抑菌活性，采用铁氰化钾还原力测定法和DPPH法测定其抗氧化活性。结果表明，在供试菌株范围内，四叶参内生真菌SYG6仅对鳗弧菌有抑菌作用，其抑菌圈直径为(6.500±0.017)mm； SYG6乙酸乙酯粗提物有一定抗氧化活性，其抗氧化性弱于阳性对照Vc和BHT。

本实验仅对四叶参内生真菌SYG6的乙酸乙酯粗提物进行了抑菌及抗氧化活性初步研究，希望能为四叶参内生真菌相关研究和四叶参资源综合开发利用提供一定参考资料。

[1] 李法曾, 张卫东, 张学杰. 泰山植物志(下卷)[M]. 山东科学技术出版社, 2012, 962-963.

[2] 陈宝芳, 毕研文, 杨永恒, 等. 泰山四叶参新品种“泰参 2 号”的选育[J]. 中国现代中药, 2013, 15(12):1064-1067.

[3] 王德才, 李同德, 徐晓燕, 等. 泰山四叶参提取物对小鼠抗氧能力的影响[J]. 中国中医药信息杂志, 2008, 15(1):37-38.

[4] 梁子宁, 朱华, 赖开平, 等. 药用植物鸦胆子内生真菌分离及其抑菌活性初步研究[J]. 中药材, 37(4):564-568.

[5] 徐旭, 杨世林, 冯育林, 等. 四叶参内生真菌 SYY1 抗氧化及抑菌活性的初步研究[J]. 江西中医药大学学报, 2016, 28 (4):80-83.

[6] 张婷婷, 郭夏丽, 黄学勇, 等. 辛夷挥发油GC-MS分析及其抗氧化、抗菌活性[J]. 食品科学, 2016, 37(10):144-150.

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Studies on the antibacterial and antioxidant activities of an endophytic fungus from Codonopsis lanceolata

ZHANGYa-jingHUANGQiao-liWANGNanZHANGNaLIUZhen-liangSunLi-yan

(Taishan Medical University, Taian 271016, China)

Objective:To study the antibacterial and antioxidant activities of endophytic fungus SYG6 crude extract from Codonopsis lanceolata. Methods:The filter paper method was used for the determination of antibacterial activity, and potassium ferricyanide reduction force measurement and DPPH method were used for the determination of antioxidant activity．Results:In the tested strains，endophytic fungus SYG6 had inhibitory effect only on Vibrio anguillarum．The antibacterial circle diameter was 6.500±0.017 mm．In the tested concentation range of 0～6 mg/ml，the reducing power of endophytic fungus SYG6 had obvious dose-effect relationship with the concentration, of which the IC50 was 1.6575 mg/ml. In the tested concentation range of 1.5～6 mg/ml, the scavenging DPPH ability increased with increasing concentration of SYG6, of which the IC50 was 4.5895 mg/ml.Conclusions:The crude extract of endophytic fungus SYG6 had certain antibacterial and antioxidant activities, which could be used as the potential resource for screening natural bioactivity constituents．

Codonopsis lanceolata;endophytic fungus;antibacterial and antioxidant activities

山东省自然科学基金项目(ZR2011CQ011)；泰安市科学技术局项目(2015NS2123)；泰医高层次培育课题(2015GCC14)；国家级大学生创新创业训练计划(201510439014，201510439083)。

张雅婧(1994—)，女，中药学专业2013级本科生。黄巧丽，女，生药学专业2016级硕士生，并列第一作者。

刘振亮，E-mail: zlliu@tsmc.edu.cn。孙立彦，硕士生导师，hhhyyy1982@163.com。

R285

A

1004-7115(2017)12-1321-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.001

2017-10-17)