牛初乳冻干粉和常乳冻干粉的降血糖及抗氧化作用

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(1.南京师范大学生命科学学院,江苏南京 210023;2.南京师范大学中北学院,江苏南京 210023;3.江苏天美健大自然生物工程有限公司,江苏南京 210046)

牛初乳冻干粉和常乳冻干粉的降血糖及抗氧化作用

王小军1,高睿嘉1,郁桦3,狄怡琳1,李玲3,王艺茗1,丁宁1,魏扬智1,于天阳2,葛文金3,王荣昌3,程光宇1

(1.南京师范大学生命科学学院,江苏南京 210023;2.南京师范大学中北学院,江苏南京 210023;3.江苏天美健大自然生物工程有限公司,江苏南京 210046)

牛初乳冻干粉,常乳冻干粉,降血糖,类胰岛素生长因子,抗氧化作用,小鼠

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛初乳冻干粉 商品名为乃捷尔牌初乳素胶囊(卫食健字【1997】第418号),由江苏天美健大自然生物工程有限公司提供。其中免疫球蛋白含量为22.3%,VC含量为28.6 mg/100 g,VE含量为9.1 mg/100 g。常乳冻干粉 为市售全脂灭菌纯牛奶(100%纯牛奶,南京卫岗乳业有限公司),经离心脱脂,采用冷冻干燥工艺加工而成。四氧嘧啶、DPPH、VC美国Sigma公司;四乙氧基丙烷(TEP) Fluka公司;NBT Biosharp公司;降糖灵(国药准字H37021531) 山东仁和堂药业有限公司;TBA、水杨酸、邻甲苯胺、邻苯二甲醛、香草醛 国药集团化学试剂有限公司。IGF-I、IGF-Ⅱ ELISA试剂盒 南京建成生物工程研究所;实验动物为昆明种90只雄性小鼠(6周龄左右),体重(25±2) g 购自南京医科大学实验动物中心。

GT1型冷冻干燥机 德国SRK系统技术有限公司;Z36HK型高速冷冻离心机 德国Hermle公司;EV300型紫外可见分光光度计 美国Thermo fisher公司;RT-6000型酶标分析仪 深圳雷杜生命科学股份有限公司;DK-8D电热恒温水浴箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及动物模型制备 小鼠按常规饲养7 d,测定基础血糖值,选合格小鼠禁食24 h后,按150 mg/kg.bw剂量腹腔注射用生理盐水配制的4%的四氧嘧啶溶液,5 d后禁食4 h,测定小鼠空腹血糖值,选取血糖值在10 mmol/L以上、尿糖呈3(+)以上的小鼠作为高血糖模型成功动物作为实验对象,依血糖值随机分层分组,每组15只,各组间血糖值无显著差异。实验[13]分正常对照组(1组)、模型组(2组)、降糖灵组(3组,100 mg/kg)、常乳冻干粉(LM)组(4组,600 mg/kg)和牛初乳冻干粉(LBC)低剂量组(5组,100 mg/kg)和高剂量组(6组,600 mg/kg)。降糖灵组每天灌胃给药(0.2 mL/10 g)、LM组和LBC组每天灌胃给予不同剂量受试样品(0.2 mL/10 g),模型组和对照组给予等量蒸馏水,连续饲养30 d,期间观察记录各组小鼠饮水、饮食量及体重变化等指标,第30 d禁食12 h后进行各项指标测定[13]。

1.2.3 羟自由基(·OH)测定 取LBC和LM加入生理盐水,超声提取20 min,于12000 r/min冷冻离心15 min,取上清液配成一定浓度的系列溶液后,按Smirnoff的水杨酸法,并根据马晓华等[16]改进方法进行实验。

1.2.4 DPPH自由基的测定 将1.2.3中离心后的上清用生理盐水配制成一定浓度的系列溶液后,按Dasgupta和Bratati的方法[17]测定DPPH·的清除作用。

1.2.5 丙二醛(MDA)含量测定 小鼠组织MDA含量测定以TEP为标准,按文献[13]进行。

1.2.6 IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和胰岛素含量测定 将LBC和LM用生理盐水配制成150 mg/mL的溶液,于12000×g 离心20 min(4 ℃),取上清液调pH至4.6,搅拌1 h,离心除酪蛋白得乳清。将乳清pH调至6.4左右,分别测定游离态IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和胰岛素含量。在测定总IGF-Ⅰ时,将200 μL乳清+800 μL酸/乙醇溶液(12.5 mL浓度为2 mol/L的HCl+87.5 mL无水乙醇)混合,25 ℃静置30 min,3500×g离心30 min,取500 μL上清液,用200 μL浓度为0.855 mol/L的Tris溶液中和[18],适当稀释后测定总IGF-Ⅰ。结合态IGF-Ⅰ=总IGF-Ⅰ-游离态IGF-Ⅰ。

采取综合防控措施，减少动物疫病的发生。坚持“预防为主、治疗为辅”的方针，散养户采取“集中免疫与适时补针”相结合，规模养殖场按程序进行免疫注射。在抓好春秋两季强制免疫工作的同时，要严格落实防疫工作责任制，切实落实免疫、监测、检疫和应急管理等各项防控措施。另外，要抓好布病、结核病、狂犬病等人畜共患病的防控和小反刍兽等外来动物疫病的防控。要引导养殖场逐步做好动物疫病的净化工作，如牛羊布病、结核病、猪伪狂犬病的净化工作。发现动物疫情严格按“早、快、严、小”的要求处理，努力确保不发生区域性重大动物疫情[2]。

IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ测定采用ELISA法,按说明书进行。胰岛素测定采用放射免疫法,按说明书进行。

1.2.7 血脂水平测定 血清总胆固醇(TC)采用邻苯二甲醛法测定[19],血清总脂采用香草醛微量法测定[19]。

1.2.8 血糖及糖耐量测定 小鼠禁食不禁水12 h后,尾静脉取血,采用邻甲苯胺超微量法(O-TB法)[20]测定血糖含量。血糖下降百分率(%)=(实验前血糖值-实验后血糖值)/实验前血糖值×100。糖耐量测定按文献[13]方法进行。

1.3 统计学处理

2 结果与分析

2.1 IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和胰岛素含量分析

IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ是LBC中的主要降血糖因子,其中IGF-Ⅰ能通过保护胰岛β细胞免受自由基的损伤,保证胰岛β细胞的结构和功能,达到对糖尿病的预防效果[31]。LBC的IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ含量分析见图1。LBC中的总IGF-Ⅰ(1146.5 ng/g)和游离态IGF-Ⅰ显著高于LM(p<0.01)。LBC中的IGF-Ⅰ有游离态和结合态两种,其中游离态IGF-Ⅰ占总IGF-Ⅰ的82.8%,是LBC中的主要IGF-Ⅰ形式,它与结合态之比为4.64∶1,但在LM中,IGF-Ⅰ主要以结合态存在,游离态和结合态之比为0.48∶1。LBC和LM中的结合态IGF-Ⅰ含量基本相同,两者之间无统计学差异。LBC的总IGF-Ⅰ和游离态IGF-Ⅰ含量分别是LM的3.2倍和7.1倍。LBC的IGF-Ⅱ含量为1303.0 ng/g,极显著高于LM(p<0.01),是LM的5.1倍。胰岛素含量测定采用放射免疫法,LBC中胰岛素含量为4.1 mIU/L,相当于128.4 ng/g胰岛素含量,LM中未检测出胰岛素。

图1 牛初乳冻干粉和常乳冻干粉的IGF-Ⅰ(A)和IGF-Ⅱ(B)含量测定Fig.1 The determination of IGF-Ⅰ(A) and IGF-Ⅱ(B)in LBC and LM注:与常乳冻干粉相比:** p<0.01。

2.2 自由基清除作用

图2 牛初乳冻干粉和常乳冻干粉的超氧自由基(A)、羟自由基(B)和DPPH·(C)的清除活性Fig.2 The scavenging activities of LBC and LM on superoxide radical(A),hydroxyl(B)and DPPH(C)radicals

2.3 对糖尿病小鼠饮水饮食、体重及免疫器官的影响

造模后的糖尿病小鼠出现多饮、多食、多尿和体重减轻,即“三多一少”症状,与对照组差异显著(p<0.01)。同时,模型组免疫器官受到一定程度损伤,其脏器指数较对照组显著降低(p<0.05或p<0.01)。服用LBC后,高剂量组的饮食、饮水量明显减少,体重有所增加,胸腺指数明显增加,与模型组相比差异有显著性(p<0.05或p<0.01),低剂量组虽然有减轻糖尿病症状趋势,但与模型组相比,其差异无显著性意义。LM对糖尿病症状和脏器指数增加有缓解趋势,但无明显改善作用(见表1)。说明LBC对糖尿病小鼠“三多一少”病症的改善和恢复被损伤的免疫器官功能有积极的预防作用。

表1 牛初乳冻干粉和常乳冻干粉对小鼠饮水饮食、体重及免疫器官的影响Table 1 The effect of LBC and LM on drinking,eating,weight body and immune organ in mice(±s,n=15)

注:与模型组相比:* p<0.05;** p<0.01;与对照组比:#p<0.05;##p<0.01,表2、表3同。

表2 牛初乳冻干粉和常乳冻干粉对糖尿病小鼠血糖、血脂的影响Table 2 The effect of LBC and LM on blood sugar and blood fat in diabetic mice

2.4 对糖尿病小鼠血糖、血脂水平的影响

结果见表2。造模后的小鼠的血糖值维持在一个较高水平,给予LM和LBC低剂量后,血糖值有所降低,血糖下降百分率有所提高,但无统计学意义。给予LBC高剂量(600 mg/kg)30 d后,能显著降低糖尿病小鼠的血糖水平,与模型组相比有显著性差异(p<0.05),其血糖下降百分率为43.4%,与阳性药物降糖灵的降血糖效果基本相当(44.6%),而模型组小鼠的血糖值仅降低16.7%。血脂测定结果表明,造模后模型组的总脂和TC水平比对照组显著升高(p<0.01),在给予LM(600 mg/kg)和LBC(100 mg/kg和600 mg/kg)后,对总脂水平未见明显的影响;对TC水平而言,在给予LBC低(100 mg/kg)、高剂量(600 mg/kg)后,LBC低剂量组的TC水平虽有所降低,但与模型组相比,无显著性差异。LBC高剂量组能显著降低TC水平(p<0.05),其TC水平(比模型组降低了36.2%)与降糖灵的TC水平(比模型组降低了34.5%)一致,并已经接近对照组的TC水平。以上结果表明,LBC能降低糖尿病小鼠的血糖水平,对因糖代谢失调而引起的胆固醇升高有一定改善作用。

2.5 对糖尿病小鼠糖耐量的影响

结果见图3。糖尿病小鼠在给予LM30 d后,在0 h的血糖值与模型组相比显示了明显的降低,但在0.5 h、1 h和2 h的血糖值与模型组相比均无显著性统计学差异。糖尿病小鼠在给予LBC(低剂量和高剂量)30 d后,在0 h的血糖值都明显低于模型组,LBC低剂量在2 h的血糖值,LBC高剂量在1 h和2 h的血糖值均明显低于模型组,分别与相应的模型组相比均有显著性统计学差异((p<0.05或p<0.01),其中,LBC组低剂量和高剂量在2 h的血糖值比相应的模型组降低了26.7%和32.5%(降糖灵的这一数值为40.6%)。血糖曲线下面积(AUC)测定表明,低、高剂量LBC的AUC都比模型组降低了18.7%和23.5%,与模型组相比均有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。提示LBC具有增加糖尿病小鼠糖耐量的作用。

2.6 对小鼠血液SOD活性、血清MDA的影响

SOD是清除超氧自由基的关键酶,它作用于清除自由基的早期起始阶段,对防御机体氧化损伤尤为重要。MDA是细胞膜脂质过氧化反应的终产物,它作为组织损伤的一种指标,已经被广泛应用于抗氧化的研究中。血液SOD活性和血清MDA含量测定结果见表3。造模后的糖尿病小鼠红细胞SOD活性在14 d和30 d明显下降,与对照组相比有显著性差异(p<0.05或p<0.01),在给予LBC后,低剂量在30 d时SOD活性提高,与模型组相比有显著性差异(p<0.05);高剂量在14 d和30 d时的SOD活性分别比模型组提高了9.0%和15.5%,与模型组相比均有显著性意义(p<0.01或p<0.05)。血清MDA含量测定结果显示,造模后小鼠血清MDA含量明显升高(p<0.01),在给予LBC高剂量后,MDA含量比模型组降低了48.6%,与模型组相比差异有显著性(p<0.01)。提示LBC能提高动物体内SOD活性,降低MDA含量,能及时清除因糖代谢失调而产生的过多自由基,有助于降低组织的脂质过氧化物水平。

表3 牛初乳冻干粉和常乳冻干粉对糖尿病小鼠血液SOD活性、血清MDA含量影响Table 3 The effect of LBC and LM on blood SOD activity and serum MDA content in diabetic mice

图3 牛初乳冻干粉和常乳冻干粉对糖尿病小鼠糖耐量的影响Fig.3 The effect of LBC and LM on the glucose tolerance of diabetic mice注:1:对照组;2:模型组;3:降糖灵组;4:LM组(600 mg/kg);5:LBC低剂量组(100 mg/kg);6:LBC高剂量组(600 mg/kg)。与对照组比:# p<0.05;## p<0.01;与模型组相比:* p<0.05;** p<0.01。

3 结论与讨论

牛初乳中含有许多生物活性物质,其中胰岛素、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ等是调节血糖代谢的重要生长因子。胰岛素是生物体调节糖代谢,控制血糖平衡的最重要激素,胰岛素分泌不足及胰岛素抵抗是形成糖尿病的主要原因。IGFs是具有胰岛素样活性的生长因子,具有降血糖、降血脂作用,对糖尿病及其并发症具有较好的治疗效果[18],其中IGF-Ⅰ是牛初乳中含量最高的生长因子,对Ⅰ型糖尿病动物的胰岛β细胞具有保护作用[12]。这些生长因子在分娩后几天的牛初乳中含量是最高的。胰岛素在分娩后第一次的奶中含量为327 ng/mL,24 h后含量降了50%,至第7 d时含量为46 ng/mL[21]。IGF-1在第1 d牛初乳中含量最高,Oda Shinnichi等报道值为449 ng/mL[32],Prosser等报道值为176 ng/mL[22],随后迅速下降,第五天含量为5 ng/mL[22],常乳平均含量为2.6 ng/mL,变化范围在1.27～8.1 ng/mL[21]。本研究所用LBC是以奶牛分娩3天内的牛初乳为原料,经冷冻干燥工艺加工而成,它不仅保留了牛初乳中大量的生长发育所需的营养物质,而且保留了含量丰富的生物活性物质(如免疫球蛋白)及生长因子等,同时,合理的加工工艺也避免了它们在干燥过程中因温度而造成的失活和防止因超滤浓缩而致小分子生长因子含量下降。经检测,LBC的IgG含量为22.7%,胰岛素含量为128 ng/g,IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ含量分别为1146.5 ng/g和1303.0 ng/g。LM的这些活性物质含量远低于LBC。牛初乳中这些生物活性物质,在采用科学合理的加工工艺后得以保留,正是LBC具有降血糖作用的物质基础。俞茂华等[10]用牛初乳提取物治疗Ⅱ型糖尿病显示了降血糖效果。丁红等[11]观察到牛初乳粉具有降低STZ糖尿病大鼠血糖及总胆固醇作用。云振宇[24-25]等研究表明,牛初乳IGF-I分离物对大鼠高血糖有一定的治疗作用,其机理为保护胰腺β-细胞免受STZ损伤,并在一定程度上促进其增殖,且有持续、稳定的降糖效应。本文研究结果表明,LBC对糖尿病小鼠的高血糖和高血脂水平都有较好的缓解作用,其降血糖机理与IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ等的活性成分密切相关。

牛初乳中IGF-Ⅰ有游离态和结合态两种形式。Prosser[22]指出在分娩和产后2 d的牛初乳中82%的IGF-Ⅰ是游离态。刘海燕和潘道东[23]研究表明,分娩后两天内的牛初乳中71%以上的IGF-Ⅰ是游离态,第6 d时,IGF-Ⅰ中的游离态低于结合态,至第14 d时,游离态占总IGF-Ⅰ的41.4%。本研究表明,LBC中IGF-Ⅰ主要是游离态,它占总IGF-Ⅰ的82.8%,LM中IGF-Ⅰ以结合态为主,游离态占总IGF-Ⅰ的36.5%。本实验测定结果与文献报道结果基本一致。牛初乳中还存在一种短链IGF-Ⅰ,它占总IGF-Ⅰ的50%[22],被认为是牛初乳中的降糖因子。短链IGF-Ⅰ与其结合蛋白有较低亲和力,与其受体有较高亲和力,具有比正常IGF-Ⅰ更高的生物学效应,其活性是正常IGF-Ⅰ活性的10倍[26]。推测在LBC中,大部分游离态IGF-Ⅰ是短链IGF-Ⅰ,这可能是LBC具有降血糖作用的主要原因之一。

本文研究表明,LBC对糖尿病小鼠具有一定的降血糖和抗氧化作用,揭示了它在预防和辅助治疗糖尿病及其并发症方面的应用潜力。进一步分析LBC的功效因子,在基因分子水平上深入探讨它的降血糖和抗氧化的作用机理,开发具有相应功能的保健食品和药品,是今后主要研究的方向。

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Hypoglycemicandantioxidationeffectoflyophilizedbovinecolostrumsandlyophilizedmilk

WANGXiao-jun1,GAORui-jia1,YUHua3,DIYi-lin1,LILing3,WANGYi-ming1,DINGNing1,WEIYang-zhi1,YUTian-yang2,GEWen-jin3,WANGRong-chang3,CHENGGuang-yu1

(1.College of Life Sciences,Nanjing Normal University,Nanjing 210023,China;2.Nanjing Normal University Zhongbei College,Nanjing 210023,China;3.Jiangsu TMG nature Biological Engineering Co.,Ltd;Nanjing 210046,China)

Objective:To study on hypoglycemic effect and antioxidative effects of lyophilized bovine colostrums(LBC)and lyophilized milk(LM). Methods:The free radical scavenging activity,IGFs and insulin content were detected by biochemical analysis. Alloxan diabetes model was induced in mice where rats were treated with Phenformin(100 mg/kg),LM(600 mg/kg)and LBC(100、600 mg/kg)respectively. Besides,normal mice were used as control. The blood glucose,glucose tolerance and antioxidant and other indicators were measured after 30 days.Results:The EC50of scavenging superoxide free radicals and DPPH free radicals were respectively 245.3,167.2 μg/mL in LBC.The content of IGF-I,IGF-Ⅱ and insulin of LBC were 1146.5,1303.0,128.4 ng/g respectively. LM had a part of scavenging effect on hydroxyl free radicals,and the content of IGFs was significantly lower than LBC and insulin was not detected. LBC made significantly improvement on diabetic mice,significantly lower blood glucose levels,reduced the content of MDA and TC in serum,enhanced the tolerance and blood SOD activity. LM had no significant improvement in blood glucose level and antioxidant index. Conclusion:LBC included higher hypoglycemic factors,producted exhibited strong radical-scavenging activityinvivothan LM,which has hypoglycemic and antioxidative effects on diabetic mice.

lyophilized bovine colostrums;lyophilized milk;hypoglycemic effect;insulin-like growth factor;antioxidation;mice

2017-05-08

王小军(1981-)，男，博士，实验师，研究方向：生物活性物质分离纯化及功能食品研究，E-mail:wangxiaojun0910@njnu.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31500373)；江苏省品牌专业支助(PPZY2015B117)。

TS252.1

A

1002-0306(2017)23-0262-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.048