单次投喂乳酸诺氟沙星在鳜鱼体内的代谢消除规律

高 蕾，罗 理，姜 兰，邓玉婷，张瑞泉，谭爱萍

( 1.中国水产科学研究院 珠江水产研究所，农业部渔用药物创制重点实验室，广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州510380； 2. 上海海洋大学 水产与生命学院，上海201306 )

单次投喂乳酸诺氟沙星在鳜鱼体内的代谢消除规律

高 蕾1,2，罗 理1，姜 兰1，邓玉婷1，张瑞泉1，谭爱萍1

( 1.中国水产科学研究院 珠江水产研究所，农业部渔用药物创制重点实验室，广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州510380； 2. 上海海洋大学 水产与生命学院，上海201306 )

水温(28±2) ℃时，按20 mg/kg的剂量给平均体质量(500±10) g的鳜鱼单次口服乳酸诺氟沙星，服药后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96 h，分别测定鳜鱼血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的药物含量，采用非房室模型分析药物在鳜鱼体内的代谢消除规律。结果显示，乳酸诺氟沙星在鳜鱼血浆、肌肉、肝脏、肾脏中的达峰时间分别为4.333、6、3、5 h，达峰质量浓度分别为3.625、2.39、33.089、19.375 mg/L，各组织中肝脏吸收的药物含量最高，其次是肾脏、血浆和肌肉；乳酸诺氟沙星在鳜鱼血浆、肌肉、肝脏、肾脏中的消除半衰期分别为42.589、131.652、16.830、30.558 h，药物在肝脏中消除速度最快，而在肌肉中消除最慢。以肌肉中药物残留限量为50 μg/kg计，建议单次投喂乳酸诺氟沙星的休药期不低于24 d。

鳜鱼；乳酸诺氟沙星；药代动力学；代谢消除；休药期

喹诺酮类药物是一类人工合成的抗菌药物[1]，它抗菌谱广、抗菌力强、口服吸收好、组织含量高、与其他抗菌药物无交叉性、不良反应少、高效、低毒[2]，广泛用于畜牧、水产等养殖业中。诺氟沙星作为第三代喹诺酮类药物的代表，主要用于治疗畜禽胃肠道、泌尿道、呼吸道的感染性病变[3]。乳酸诺氟沙星是在诺氟沙星的基础上增加一个乳酸根离子，水溶性比原来高上千倍，在动物体内的生物活性也相应提高了2～3倍，在水产上主要用于治疗赤皮病、肠炎、疥疮病、烂鳃病、败血症等细菌性疾病。乳酸诺氟沙星药效好、杀菌力强、半衰期长、代谢稳定、不易产生耐药性和弱蓄积[4]等，被认为是畜禽养殖业较为理想的抗菌药物。

鳜鱼(Sinipercachuatsi)是一种名贵的淡水经济鱼类，在其养殖培育过程中，亦会感染某些细菌性疾病[5]。喹诺酮类药物是解决此问题的常用药物之一，而药动学研究是指导科学合理用药的主要依据。国内外学者已开展了诺氟沙星在草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[6]、鲫鱼(Carassiusauratus)[7]、中华鳖(Trionyxsinensis)[8]、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[9]、花鲈(Lateolabraxjaponicus)[10]、中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)[11]、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[12]和日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)[13]等多种水产动物体内的药代动力学研究，但目前仍未见乳酸诺氟沙星在鳜鱼体内的药代动力学研究。本研究检测了乳酸诺氟沙星在鳜鱼不同组织的药动学参数，探讨药物在鳜鱼体内的吸收和消除规律，为指导合理用药和保障食品安全提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

鳜鱼平均体质量(500±10) g，健康无病，购自广东省佛山市三水某水产养殖场，试验前在养殖池内暂养7 d。试验在玻璃鱼缸内进行，加入自来水并控制水温为(28±2) ℃，用增氧泵充氧，投喂不含任何药物的饵料。试验前抽样检测试验鱼，各组织不存在乳酸诺氟沙星残留，给药前1 d停饵。

乳酸诺氟沙星可溶性粉原粉(含量10%)购自广州市和生堂动物药业有限公司；乳酸诺氟沙星标准品(含量97.2%，批号H0191003)购自中国兽医药品监察所；磷酸(分析纯)购自广东光华科技股份有限公司；三乙胺(分析纯)购自广州化学试剂厂；甲醇、乙腈和正己烷均为色谱纯，购自迪马公司。提取液：0.025 mol/L磷酸溶液(三乙胺调pH 3.0)与乙腈以1∶3的比例混合。

试验仪器：超声波清洗机(宁波新芝SB-5200D)；离心机(SIGMA 3K15)；振荡器(太仓市科教器材厂VORTEX SHAKER WH-861型)；氮吹浓缩仪(美国Organomation associate公司)；分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；瑞士Mettler Toledo FE20 pH计；高效液相色谱仪(Waters-2695并配有Waters-2475 荧光检测器)等。

1.2 方法

试验鱼分为12组(6尾/组)，给药剂量(按乳酸诺氟沙星计)为20 mg/kg，单次药饵饲喂，无回吐者作为试验对象保留；另取6尾饲以空白饵料作对照。分别于给药后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96 h采集鳜鱼血液、背部去皮肌肉、肝脏和肾脏样品。空白对照组样品于96 h时采集。

尾静脉取血：1%肝素钠抗凝，常温下8000 r/min离心5 min，吸取上层血浆置于新的离心管中。血浆及组织样品均置于冰箱中-20 ℃保存。

1.3 样品处理方法

血浆样品：取1.0 mL血浆样品至50 mL离心管中，添加1.0 mL流动相，振荡1 min，40 ℃水浴下氮气吹干，用1.0 mL流动相溶解，加入3.0 mL正己烷， 8000 r/min离心5 min，取下层液体0.45 μm针孔滤膜过滤后上机检测。

肌肉、肝脏、肾脏等样品：称取1.0 g 肌肉组织(1.0 g 肝脏组织或0.5 g肾脏组织)置于50 mL离心管，添加10 mL提取液，均质1 min，8000 r/min离心5 min，取上清液放入另一50 mL离心管中，40 ℃水浴下氮气吹干。使用1.0 mL流动相溶解，5 mL正己烷除脂后，8000 r/min离心3 min，取下层液体经0.45 μm针孔滤膜过滤后上机检测。

1.4 色谱条件及测定方法

色谱柱为Waters symmetry C18色谱柱(150 nm×46 mm,5 μm)；流动相为0.025 mol/L磷酸溶液(三乙胺pH 3.0)-乙腈(87∶13,体积比), 过滤脱气后现用；等度洗脱，流速为0.6 mL/min；柱温为25 ℃；激发波长为278 nm；发射波长为450 nm；进样量为20 μL，用高效液相色谱仪检测，按外标法以峰面积计算含量[14-15]。

1.5 回收率测定

分别取1.0 mL血浆和组织样品(1.0 g肌肉、1.0 g肝脏或0.5 g肾脏)，添加标样制得0.25、0.50、1.00 mg/L(或mg/kg)的加标样品，每个质量浓度做3个重复。按照1.3方法进行处理，测定方法的平均回收率及标准差。

1.6 灵敏度的确定

准确取1.0 mL血浆或组织样品(1.0 g肌肉、1.0 g肝脏或0.5 g肾脏)，转移至50 mL离心管中，分别加入乳酸诺氟沙星标准液，制备0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 mg/L(或mg/kg)的混标样品(n=3)。按照1.3方法处理，制备工作曲线。以3倍信噪比为检测限。

1.7 数据处理

药物代谢动力学相关数据使用DAS 3.0软件处理，用Microsoft Excel 2007软件绘制各组织中的药—时曲线图，药物残留数据使用休药期软件WT 1.4拟合。

2 结果与分析

2.1 标准曲线、相关系数、回收率及最低检测线

在上述的色谱条件下，基线平稳，乳酸诺氟沙星的保留时间约为11.8 min(图1)，无干扰峰出现。本研究采用在鳜鱼各组织中加标制备不同质量浓度的乳酸诺氟沙星，外标法定量，结果表明，该药物在0.25～16.00 mg/L(mg/kg)范围内线性关系良好，r2均大于0.999(表1)。

表1 乳酸诺氟沙星在鳜鱼4种组织中的标准曲线、相关系数及绝对回收率

荧光检测器检测表明，本试验条件下最低检测限为0.01 μg/mL。日内精密度与日间精密度均小于10%，可满足乳酸诺氟沙星的药代动力学研究。

2.2 乳酸诺氟沙星在鳜鱼体内的药—时曲线

按20 mg/kg剂量单次药饵饲喂后,乳酸诺氟沙星在鳜鱼各组织中的药—时曲线均有双峰现象；首次峰值之后药物质量浓度迅速下降，之后又形成第二个峰值。乳酸诺氟沙星在鳜鱼各组织的药—时曲线见图2～图5。该药物在肝脏中的达峰时间最早，在肌肉中的达峰时间最晚。

2.3 乳酸诺氟沙星在鳜鱼体内的药动学参数

药动学参数显示(表2)，(28±2) ℃下，乳酸诺氟沙星在血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的达峰时间分别为4.333、6、3、5 h，达峰质量浓度分别为3.625、2.39、33.089、19.375 mg/L，其中，肝脏中药物质量浓度最高，达峰时间最短；肌肉中药物质量浓度最低，达峰时间最长。在各组织中的消除半衰期依次为：肝脏>肾脏>血浆>肌肉，该药物在肝脏中消除速率最快，在肌肉中消除速率最慢。

2.4 休药期

欧盟规定，氟喹诺酮类药物在食品动物肌肉中最大允许残留量为100 μg/kg，在肝脏和肾脏中为200 μg/kg，在有关家禽及猪可食组织中诺氟沙星的最大允许残留量为50 μg/kg[16]，诺氟沙星在水产品中的最大允许残留量尚未确定，本试验暂以鳜鱼肌肉中药物含量50 μg/kg为残留量计，通过休药期软件WT 1.4计算得出，本试验条件下乳酸诺氟沙星在鳜体内的休药期为24 d。

图1 乳酸诺氟沙星标准品色谱图

图2 乳酸诺氟沙星在鳜鱼血液中的药—时曲线

图3 乳酸诺氟沙星在鳜鱼肌肉中的药—时曲线

图4 乳酸诺氟沙星在鳜鱼肝脏中的药—时曲线

图5 乳酸诺氟沙星在鳜鱼肾脏中的药—时曲线

参数单位血浆肌肉肝脏肾脏达峰时间tmaxh4．333635峰质量浓度Cmaxmg/L3．6252．3933．08919．375表观分布容积Vz/FL/kg21．95627．7971．2243．686消除半衰期t1/2zh42．589131．65216．8330．558AUC(0～t)mg/L·h48．9580．817423．347250．287AUC(0～∞)mg/L·h55．872148．776431．163271．13AUC(t～∞)%87．68354．61798．493．95MRT(0～t)h23．31742．46617．04321．065MRT(0～∞)h40．374164．25918．75428．817

注：AUC(0～t)为药物质量浓度0～t时间曲线下面积；AUC(0～∞)为药物浓度0～∞时间曲线下面积；AUC(t～∞)为药物质量浓度t～∞时间曲线下面积百分比； MRT(0～t)为0～t平均滞留时间；MRT(0～∞)为0～∞平均滞留时间.

3 讨 论

3.1 乳酸诺氟沙星的吸收特点

在本试验中鳜鱼各组织的药物质量浓度—时间关系曲线均出现两个药物质量浓度峰，即“双峰”现象。关于药物吸收的“双峰”或“多峰”现象已有报道，如凡纳滨对虾中血药质量浓度的双峰现象[12]；药浴和药饵两种给药方式下，诺氟沙星在中国明对虾体内的双峰现象[11]；大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)中的双峰现象[17]，及复方磺胺嘧啶在吉富罗非鱼(GIFT，Oreochromisniloticus)肝脏和肾脏中的双峰现象[18]等。

达峰时间、达峰质量浓度和药—时曲线下面积是药代动力学研究中代表药物吸收分布的重要参数。本研究中乳酸诺氟沙星在肝脏和肾脏中的药物质量浓度比血浆和肌肉中高，说明该药物在鳜鱼体内主要以肝脏代谢和肾脏排泄为主；而血浆、肌肉、肝脏和肾脏中的0～96 h药时曲线下面积分别为48.95、80.817、423.347、250.287 mg/L·h，表明药物在各组织中分布良好，可以在机体组织器官中维持较高的药物水平。

3.2 乳酸诺氟沙星的生物利用度

喹诺酮类药物的乳酸盐比药物本身更易溶于水、易于吸收、生物利用度高。刘玉林[17,19-21]等发现，不同给药剂量混饲时，诺氟沙星在大黄鱼(给药剂量10 mg/kg)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)(给药剂量10 mg/kg)、奥尼罗非鱼(O.aureus×O.niloticus)(给药剂量20 mg/kg)和大菱鲆(Scophthalmusmaximus)(给药剂量30 mg/kg)血浆中的达峰时间和达峰质量浓度分别为2.09、1.45、2.72、2 h和0.89、1.72、0.55、8.36 μg/mL；而本试验中，给药剂量为20 mg/kg时，乳酸诺氟沙星在鳜鱼血浆中的达峰时间和达峰质量浓度分别为4.33 h和3.63 mg/L，可能是由于乳酸诺氟沙星的水溶性较诺氟沙星强，增强了药物的吸收性。

范红照等[22]比较了乳酸诺氟沙星、烟酸诺氟沙星和诺氟沙星在鳗鲡(Anguillajaponica)体内的吸收特性，结果显示，在相同的水温、给药剂量和给药方式下，乳酸诺氟沙星的达峰时间(4 h)长于诺氟沙星的达峰时间(3 h)；而乳酸诺氟沙星(368.28 L/kg)和烟酸诺氟沙星(100.86 L/kg)的表观分布容积均大于诺氟沙星(28.97 L/kg)；表明乳酸诺氟沙星的渗透力比诺氟沙星更强，吸收分布效果更好，生物利用度更高。此外，在畜禽等其他动物的喹诺酮类药物的相关研究中[23-24]，也发现在相同条件下，无论静脉注射还是口灌给药，“乳酸化”的药物吸收穿透力强，吸收分布效果更好，生物利用度更高。

3.3 乳酸诺氟沙星的消除规律

消除半衰期和药物平均滞留时间是体现药物在动物体内消除特征的两个重要参数。乳酸诺氟沙星在鳜鱼血浆、肌肉、肝脏和肾脏组织中的消除半衰期分别为42.589、131.652、16.83、30.558 h，0～96 h药物平均滞留时间分别为23.317、42.466、17.043、21.065 h，药物在各组织中的消除速率为：肌肉<血浆<肾脏<肝脏，药物在鳜鱼肌肉中的消除最慢。在大黄鱼[17]、奥尼罗非鱼[20]、大菱鲆[21]的相关研究中均发现，诺氟沙星在不同水产动物肌肉中的消除均较其他组织缓慢，其消除半衰期分别为223. 55、294.77、12.39 h。表明诺氟沙星药物在水产动物肌肉中消除缓慢。

本试验中，乳酸诺氟沙星在鳜鱼肝脏、肾脏、血浆、肌肉中的(0～∞)平均滞留时间分别为18.75、28.82、40.37、164.26 h，鳜鱼血浆中的(0～∞)平均滞留时间为40.374 h，与范红照等[22]的研究结果相似，即乳酸诺氟沙星在鳗鲡血浆中的消除半衰期为25.89 h，(0～∞)平均滞留时间为38.96 h；而鳜鱼肌肉组织中的(0～∞)平均滞留时间为164.26 h，远高于其他组织，亦大于0～96 h平均滞留时间值42.47 h；表明乳酸诺氟沙星在水产动物肌肉中的滞留时间较长。以肌肉中药物含量不超过50 μg/kg为残留限量计，乳酸诺氟沙星药物的休药期为24 d以上。

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PharmacokineticsandRemovalofNorfloxacinLactateinMandarinFishSinipercachuatsiatSingle-doseage

GAO Lei1,2, LUO Li1, JIANG Lan1, DENG Yuting1,ZHANG Ruiquan1,TAN Aiping1

( 1.Key Laboratory of Fishery Drug Development, Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Aquatic Animal Immune Technology of Guangdong Province, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China; 2.College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China )

The drug concentrations in plasma, muscle, liver, and kidney were detected in mandarin fishSinipercachuatsiorally administrated by norfloxacin lactate at a single dose of 20 mg/kg body weight at (28±2) ℃ 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 and 96 h after oral administration by high performance liquid chromatography (HPLC) method in order to study the metabolism and elimination of norfloxacin lactate. The results showed that the peaking time (tmax) of the drug was 4.333 h in plasma, 6 h in muscle, 3 h in liver and 5 h in kidney, and that the corresponding maximal drug concentration (Cmax)3.625 mg/L in plasma, 2.39 mg/L in muscle, 33.089 mg/L in liver and 19.375 mg/L in kidney, with the maximal absorption of the drug in liver, and followed by in kidney, plasma and muscle. The elimination half-life (t1/2z) of norfloxacin lactate was 42.589 h in plasma, 131.652 h in muscle, 16.830 h in liver and 30.558 h in kidney, the most rapid elimination of norfloxacin lactate in liver and the slowest in muscle. It is recommended that the withdrawal time be more than 24 d under this experiment condition according to the maximum residue limit (MRL) of 50 μg/kg in muscle.

Sinipercachuatsi; norfloxacin lactate; pharmacokinetics; metabolic elimination; withdrawal period

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.01.017

S965.199

A

1003-1111(2017)01-0099-05

2016-03-16；

2016-05-06.

国家公益性行业(农业)科研专项(201203085).

高蕾(1990—)，女，硕士；研究方向：药物动力学.E-mail：gaoleishanshan@163.com.通讯作者：姜兰(1965—)，女，研究员；研究方向：水产病害防治.E-mail：fanjianglan@hotmail.com.