普安银鲫胚胎发育中脂质代谢酶基因的表达及葡萄糖的影响

蒋左玉，熊铧龙，姚俊杰， 安 苗

( 1.贵州省瓮安县农村工作局，贵州 瓮安 550400； 2. 贵州大学 动物科学学院,水产科学系，高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025 )

普安银鲫胚胎发育中脂质代谢酶基因的表达及葡萄糖的影响

蒋左玉1，熊铧龙1，姚俊杰2， 安 苗2

( 1.贵州省瓮安县农村工作局，贵州 瓮安 550400； 2. 贵州大学 动物科学学院,水产科学系，高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025 )

采用荧光定量PCR技术检测了普安银鲫胚胎发育中乙酰辅酶A羧化酶α、脂肪酸合成酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶基因表达的特点及葡萄糖浸泡的影响，以探讨乙酰辅酶A羧化酶α、脂肪酸合成酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶基因在普安银鲫胚胎发育中的表达及mRNA表达水平及葡萄糖对这4种基因mRNA表达量的影响。试验结果显示，乙酰辅酶A羧化酶α、脂肪酸合成酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶基因在普安银鲫的成熟卵期均有表达，且随胚胎发育而上升。在15 g/L葡萄糖处理组中，乙酰辅酶A羧化酶α、脂肪酸合成酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶从原肠期至出膜前期mRNA表达量升高。在原肠期、晶体出现期和出膜前期，葡萄糖能显著上调脂肪酸合成酶和乙酰辅酶A羧化酶α mRNA的表达(P<0.05)。在原肠期，葡萄糖能稍上调脂蛋白脂酶和肝脂酶 mRNA的表达，但差异不显著(P>0.05)。在晶体出现期和出膜前期，葡萄糖能显著上调脂蛋白脂酶和肝脂酶mRNA的表达(P<0.05)。研究表明,乙酰辅酶A羧化酶α、脂肪酸合成酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶属母源性酶类，其合子基因在原肠期已经开始表达。适宜水平的葡萄糖促进脂肪酸合成酶和乙酰辅酶A羧化酶α mRNA的表达有利于脂肪酸合成酶和乙酰辅酶A羧化酶α的积累，为仔鱼出膜做准备；促进脂蛋白脂酶和肝脂酶 mRNA表达有利于脂质的分解供能。

普安银鲫；胚胎发育；脂质代谢酶；基因表达；葡萄糖

卵生鱼类在整个内源营养发育过程中，生长发育所需的营养和能量均来自卵黄物质。鱼类早期发育中各种组织器官的形成均分解利用卵黄物质，而脂质是一种含能量高于蛋白质和糖类2.25倍的高能量营养物质，对淡水和海水鱼类鱼体组织构建和生理调节具有重要作用[1]。脂质代谢需要相关酶的参与，这些酶参与调解脂质的分解利用与合成储存的机制尚不十分清楚。有研究显示，在成熟的卵细胞中已经检测到脂质代谢相关酶的活性[2-5]，说明最初调控脂质代谢的酶来自母体，是母源性酶类，对启动胚胎发育具有重要作用。受精卵的形成意味着新生命的开始，随着发育这些母源性酶类的贮备有限，为确保胚胎发育顺利进行，势必需要产生新的酶类来执相同功能，但这些新酶(即合子基因)的表达时间及表达水平需要探究。

普安银鲫(Carassiusauratusgibelio)为生活在贵州省普安县青山镇一带高原水域中的天然雌核发育种群，在自然界孵化率及仔鱼成活率较低。目前，已对其人工繁育、早期发育中消化生理及脂质代谢酶活性等进行了一些研究[2-6]，但对胚胎发育中脂质代谢酶的基因表达了解甚少[7]。葡萄糖是一种水溶性营养因子，适宜添加能促进鱼类、贝类的胚胎发育[8-10]和鱼体内脂质代谢酶活性[2-4,11-13]，葡萄糖作为糖代谢与脂代谢的交汇点，对脂代谢具有重要作用，目前其对鱼类基因表达量影响的研究尚未见报道。本试验从合成和分解两方面探究普安银鲫胚胎发育中乙酰辅酶A羧化酶α、脂肪酸合成酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶基因的相对表达量，探究葡萄糖溶液浸泡对其相对表达量的影响，以促进该鱼人工胚胎发育的顺利进行，提高卵的孵化率和健康度。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用母本为培育成熟好的普安银鲫，父本为兴国红鲤(Cyprinuscarpio)，人工催产后进行干法异源受精。受精卵放在装有17 L水的试验水箱中孵化，水温为(24±0.5) ℃。在前期试验结果[8]基础上将葡萄糖质量浓度设为0 g/L和15 g/L，每8 h全部换一次同温度试验用水。试验过程中用充气泵充气，每个质量浓度均设3个平行组，共6组试验。准确采取6个试验组中成熟卵、受精卵、原肠期、晶体出现期及出膜前期5个时期的样品材料，用滤纸吸干样品表面水分后放入无菌1.5 mL的离心管中，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 4种酶mRNA表达量的测定

1.2.1 总RNA的提取与逆转录

首先采用Trizol法提取总RNA，用逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录为cDNA。

1.2.2 引物设计与合成

从NCBI上查找银鲫物种或近缘物种的核酸系列，采用Primer 5.0与引物比对软件设计其保守序列特异性引物。本试验内参基因为β-actin，β-actin、脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶α、脂蛋白脂酶和肝脂酶基因引物分别为,β-actin(登录号：NM_181601.4)上游引物：TCCCTGTATGCCTCTGGTCGTA，下游引物：TGGTGAAGCTGTAGCCTCTCTC；脂肪酸合成酶(登录号：KF511494.1)上游引物：GACAAGCGGTTGGCAAACAT，下游引物：CTGGCGTCTACATTGGAGTAAGTG；乙酰辅酶A羧化酶α(登录号：KF499584.1)上游引物：CTGAAAGAATGGGTGGAACGTC，下游引物：CTACGGCAGGAGGGATACGG；脂蛋白酯酶(登录号：FJ204474.1)上游引物：ATGGACGGTCACGGGTATGT，下游引物：ATGTAGGGTAGTGCTGTTGC；肝脂酶(登录号：FJ204474.1)上游引物：ATGGACGGTCACGGGTATGT，下游引物：ATGTAGGGTAGTGCTGTTGC。

1.2.3 4种酶基因相对表达量的测定

相对荧光定量采用SYBR Green Ⅰ法。将4种酶基因和β-actin基因PCR产物进行纯化，分别以纯化产物为模板，用无菌水将模板进行10倍梯度稀释，以4种基因和β-actin基因相对应的引物分别进行实时荧光定量PCR扩增，设定好反应程序后仪器自动生成标准曲线、扩增效率及曲线拟合度、熔解曲线。每个平行组样本均做3个重复测定，每次试验时设阴性对照。

1.3 数据分析

采用Ct法(Qr=2-△△Ct)计算相对表达量，以β-actin进行标准化校正。用SPSS 17.0软件统计分析算出的相对表达量值，结果用平均值±标准差表示(n=9)，以P<0.05表示差异显著。正常发育组中以成熟卵为对照组，对正常组中5个样品表达量值进行单因素方差分析和Duncan法多重比较；葡萄糖组的对照组为正常组相对应的时期，用t检验分析两数据组间的差异。

2 结 果

2.1 普安银鲫胚胎发育中4种酶mRNA的表达量

整个发育过程中4种酶基因的mRNA表达量上升，与成熟卵相比，受精卵中4种酶基因相对表达量均稍有上升，差异不显著(P>0.05)。在原肠期、晶体出现期和出膜前期脂肪酸合成酶 mRNA相对表达量分别为成熟卵的2.593倍、3.006倍和6.397倍，均显著高于成熟卵(P<0.05)。在原肠期，乙酰辅酶A羧化酶α mRNA相对表达量稍高于成熟卵，但在晶体出现期和出膜前期，其表达量分别为成熟卵的5.597倍和8.188倍，显著高于成熟卵(P<0.05)。在出膜前期，脂蛋白脂酶 mRNA相对表达量为成熟卵的8.325倍，显著高于成熟卵(P<0.05)。在晶体出现期和出膜前期肝脂酶 mRNA相对表达量分别为成熟卵的3.874倍和8.946倍，显著高于成熟卵(P<0.05)(图1)。

图1 普安银鲫胚胎发育中乙酰辅酶A羧化酶α、脂肪酸合成酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶 mRNA的相对表达量同一图柱上标不同字母的基因表示不同时期间有显著差异(P<0.05)， 下同.

2.2 葡萄糖对普安银鲫胚胎发育中乙酰辅酶A羧化酶α和脂肪酸合成酶mRNA相对表达量的影响

整个发育过程中，葡萄糖组乙酰辅酶A羧化酶α和脂肪酸合成酶mRNA表达量均呈上升趋势。与对照组相比，在原肠期、晶体出现期和出膜前期，葡萄糖组两种酶mRNA的表达量均显著高于对照组(P<0.05)，相应时期的脂肪酸合成酶 mRNA分别为对照组的1.357倍、1.907倍和2.414倍。乙酰辅酶A羧化酶α mRNA分别为相应时期对照组的1.379倍、1.596倍和2.407倍(图2)。

图2 葡萄糖对普安银鲫胚胎发育过程中乙酰辅酶A羧化酶α和脂肪酸合成酶mRNA相对表达量的影响

2.3 葡萄糖对普安银胚胎发育中脂蛋白脂酶和肝脂酶 mRNA相对表达量的影响

整个发育过程中，葡萄糖组脂蛋白脂酶和肝脂酶 mRNA表达量均上升。在原肠期，葡萄糖组脂蛋白脂酶mRNA的表达量稍有上升，差异不显著(P>0.05)。但在晶体出现期和出膜前期，葡萄糖组脂蛋白脂酶 mRNA的表达量显著高于对照组(P<0.05)。在晶体出现期和出膜前期，葡萄糖能显著上调肝脂酶 mRNA的表达(P<0.05)。脂蛋白脂酶 mRNA分别为相应时期对照组的1.081倍、2.475倍和2.922倍。肝脂酶 mRNA分别为对照组相应时期的1.034倍、1.472倍和1.608倍(图3)。

3 讨 论

卵生鱼类在内源营养阶段对脂质的利用有限，必须通过机体内重新合成才能确保胚胎顺利发育。合成与分解代谢贯穿了鱼类早期发育的过程，这个过程需要许多脂质代谢酶的参与。在合成代谢中，脂肪酸合成酶和乙酰辅酶A羧化酶α对脂质的合成及沉积具有重要作用，在分解代谢中，脂蛋白脂酶和肝脂酶合称总脂酶，对降解脂质供能具有重要作用。

研究表明，普安银鲫成熟卵中具有乙酰辅酶A羧化酶α、脂肪酸合成酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶活性，说明这4种酶由母体带来，以分解脂质启动胚胎发育。与前期试验结果中能在成熟卵中检测到酶活性的研究结果一致，这更加证明在成熟卵中已具备了这些脂质代谢酶，且这些酶基因较高的表达量为胚胎发育的顺利进行提供了保障。经异源授精30 min后，4种酶基因表达均高于成熟卵，且主要为脂肪酸合成酶和脂蛋白脂酶起作用。授精后胚胎开始进行卵裂，脂蛋白脂酶 mRNA表达量升高有利于启动胚胎发育，而脂肪酸合成酶 mRNA表达量的升高可为受精后卵膜的形成及卵裂提供物质基础。胚胎发育至原肠期时这4种酶基因的表达量均显著升高，说明此时4种酶已实现由母源型基因向合子基因转变的表达，为胚胎期器官的形成及组织构建提供了基础。这些研究结果说明，母源性基因与合子基因在胚胎发育中起着不同的作用，原肠期是合子基因开始表达的一个关键时期[14-15]。在整个发育过程中，分解代谢中脂蛋白脂酶 mRNA的表达量高于合成酶基因的表达量，其原因可能是原肠期大量器官原基开始形成[6]，需要消耗更多的能量。在以晶体出现期为代表的器官形成阶段，两种分解酶基因表达量增加，说明胚胎发育至器官形成阶段时，卵黄中的脂类作为主要的营养物质而代谢利用[16]，同时，两种合成酶基因表达的增加有利于脂类的合成，满足机体生物膜等组织的构建与能量供应。至出膜前期4种酶基因的表达量达最高，此时消化系统和血液循环系统的发育不断趋于完善，胚体不断转动，即将出膜，胚胎的新陈代谢旺盛，耗能大[6]，表达量的升高有利于胚胎发育和仔鱼出膜的生理需求。

目前，葡萄糖对脂质代谢酶基因表达的相关研究主要集中在小鼠、禽类等动物上[17-19]，这些研究结果说明葡萄糖能诱导乙酰辅酶A羧化酶α、脂肪酸合成酶和脂蛋白脂酶基因表达。本试验结果表明，在15 g/L葡萄糖处理组中，普安银鲫胚胎从原肠期到出膜前期，乙酰辅酶A羧化酶α和脂肪酸合成酶的基因表达量呈上升变化，且葡萄糖组的表达量均显著高于对照组，说明外源葡萄糖的介入能诱导乙酰辅酶A羧化酶α、脂肪酸合成酶的表达。葡萄糖组脂蛋白脂酶和肝脂酶的基因表达量呈上升变化，且高于对照组，在原肠期，两种脂质分解酶基因表达量稍有上升，其可能原因为葡萄糖进入胚胎内直接作为部分能源物质供应胚胎发育。而发育至晶体出现期和出膜前期时，脂蛋白脂酶和肝脂酶的mRNA水平提高可以加快脂蛋白脂酶和肝脂酶分解甘油三酯供能，减少甘油三酯的外运，使更多的脂肪被组织利用和贮存[1]，此期间是各器官、组织构建的关键期，两种脂质分解酶基因表达量显著升高有利于脂质的分解供能，保障仔鱼的顺利出膜。乙酰辅酶A羧化酶α、脂肪酸合成酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶的mRNA表达显著高于对照组，其原因可能为葡萄糖从基因转录、mRNA的加工、稳定性和翻译等方面来调控乙酰辅酶A羧化酶α、脂肪酸合成酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶基因的表达[20]。综上研究表明，适宜水平的葡萄糖可以通过调节脂质代谢酶的表达来维持机体内脂质代谢的动态平衡。

[1] Cejas J R, Almansa E, Jérez S, et al. Changes in lipid class and fatty acid composition during development in white seabream (Diplodussargus) eggs and larvae[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 139(2): 209-216.

[2] 蒋左玉, 姚俊杰, 熊铧龙. 普安银鲫早期发育过程中消化酶活性变化及外源维生素C对其的影响[J]. 动物营养学报, 2014, 26(5):1246-1253.

[3] 蒋左玉, 姚俊杰, 安苗,等. 普安银鲫胚胎发育中两种脂酶活性及葡萄糖对其活性的影响[J]. 淡水渔业, 2014(4):3-6.

[4] 蒋左玉, 姚俊杰, 安苗,等. 葡萄糖、维生素 C浸泡对普安银鲫胚胎发育中乙酰辅酶 A羧化酶、脂肪酸合成酶及肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅰ活性的影响[J]. 动物营养学报, 2014，26(11):3510-3516.

[5] 朱俊华, 姚俊杰, 冯亚楠, 等. 瓯江彩鲤早期发育中两种脂酶活性及间甲酚对其活性的影响[J]. 淡水渔业, 2014, 44(1):32-35.

[6] 梁正其, 马珊, 姚俊杰, 等. 普安银鲫胚胎发育的初步研究[J]. 水产科学, 2012, 31(6):316-320.

[7] 姚俊杰, 朱俊华, 朱忠胜,等. 普安银鲫成熟卵及受精后FAS和ACC的表达[J]. 贵州农业科学, 2015(2):107-109.

[8] 熊铧龙，姚俊杰，安苗，等．葡萄糖、维生素C对普安银鲫早期发育的影响[J]. 南方水产科学，2014，10(6):89-93.

[9] 李俊霞.葡萄糖、蔗糖、氯化钠对斑马鱼胚胎发育的影响[D].济南：山东师范大学，2007.

[10] 薛凌展. 环境和营养因子对四倍体栉孔扇贝胚胎及早期幼虫的影响[D]. 福州：福建师范大学, 2008.

[11] Cui X J, Zhou Q C, Liang H O, et al. Effects of dietary carbohydrate sources on the growth performance and hepatic carbohydrate metabolic enzyme activities of juvenile cobia (RachycentroncanadumLinnaeus) [J].Aquaculture Research, 2010,42(1):99-107.

[12] Hung S S, Storebakken T. Carbohydrate utilization by rainbow trout is affected by feeding strategy [J]. The Journal of Nutrition, 1994, 124(2):223-230.

[13] Hung S S, Fynn-Aikins F K, Lutes P B, et al. Ability of juvenile white sturgeon (Acipensertransmontanus) to utilize different carbohydrate sources[J]. The Journal of Nutrition, 1989, 119(5):727-733.

[14] Wu C F, Chan A P Y, Etkin L D. Difference in the maternal and zygotic contributions of tumor head on embryogenesis[J]. Developmental Biology, 2003, 255(2):290-302.

[15] 潘正军，陈忠科. 动物胚胎发育早期母源性基因表达研究进展[J]. 生物学通报, 2004, 39(9):5-7.

[16] Gunasekera R M, De Silva S S, Ingram B A. Early ontogeny related changes of the fatty acid composition in the Percichthyid fishes trout cod,Maccullochellamacquariensisand murray cod,M.peeliipeelii[J]. Aquatic Living Resources, 1999, 12(3):219-227.

[17] 黄惠兰, 韩春春, 王继文,等. 葡萄糖对鹅原代肝细胞脂质沉积相关基因及酶活性的影响[J]. 生命科学研究, 2013, 17(6):528-532.

[18] Spence J T, Pitot H C. Induction of lipogenic enzymes in primary cultures of rat hepatocytes[J]. European Journal of Biochemistry, 1982,128(1):15-20.

[19] Sartippour M R, Renier G. Differential regulation of macrophage peroxisome proliferator-activated receptor expression by glucose role of peroxisome proliferator-activated receptors in lipoprotein lipase gene expression[J]. Arteriosclerosis,Thrombosis, and Vascular Biology, 2000, 20(1):104-110.

[20] Clarke S D, Abraham S. Gene expression: nutrient control of pre- and posttranscriptional events [J]. Faseb Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 1992, 6(13):3146-3152.

ExpressionandEffectsofGlucoseonLipidMetabolismGenesduringEmbryonicDevelopmentofCrucianCarpCarassiusauratusgibelioinPu′anCountyinGuizhouProvince

JIANG Zuoyu1, XIONG Hualong1, YAO Junjie2, AN Miao2

( 1. Rural Work Bureau of Weng′an County, Guizhou Province, Weng′an 550400, China; 2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region, Ministry of Education， Department of Fisheries Science,College of Animal Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China )

Fluorescence quantitative PCR techniques were used to detect the gene expression of acetyl coenzyme A carboxylase α (ACCα), fatty acid synthase (FAS), lipoprotein lipase (LPL) and hepatic lipase (HL) and the effects of glucose solution treatment on the expression of the above genes during embryonic development of crucian carpCarassiusauratusgibelioin Puan County in Guizhou Province. The results showed that there were expressions of FAS, ACCα, LPL and HL genes in the mature egg-stage, and that the expressions exhibited an increasing trend during the embryonic development. In the 15 g/L glucose group, the expressions of FAS, ACCα, LPL and HL mRNA all showed up-rugated changes from gastrula stage to the early hatching, and glucose significantly heightened the expression of FAS and ACCα mRNA (P<0.05). In the gastrula stage, glucose slightly improved the expressions of LPL and HL mRNA, without significant difference (P>0.05). However, glucose led to significantly heighten the expressions of LPL and HL mRNA in the lense appearance stage and hatching (P<0.05). The findings indicate that FAS, ACCα, LPL and HL are maternal enzymes, and the zygotic genes of the four kinds of enzymes in the gastrula stage had already begun to express. Appropriate levels of glucose promoted the expressions of FAS and ACCα mRNA, which is beneficial to the accumulation of FAS and ACCα, in preparation for the larval emergence. Promoting expressions of LPL and HL mRNA facilitated lipid breakdown and energy releasing.

Carassiusauratusgibelio; embryonic development; lipid metabolic enzyme; gene expression; glucose

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.017

S965.199

A

1003-1111(2017)03-0359-05

2016-05-04；

2016-07-07.

国家自然科学基金资助项目(31160527).

蒋左玉(1989-)，女，工程师，硕士；研究方向：水产动物繁殖与发育生物学. E-mail: gzuzyujiang@163.com.通讯作者： 姚俊杰(1968-)，男，教授，硕士生导师，博士；研究方向：水产动物繁殖与发育生物学. E-mail: junjieyao@163.com.