HPLC法同时测定墓头回中齐墩果酸和熊果酸的含量

陈杨芳，张林松，陈晓风，闫丽丽

HPLC法同时测定墓头回中齐墩果酸和熊果酸的含量

陈杨芳1，张林松1，陈晓风1，闫丽丽2

目的建立高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）同时测定墓头回药材中齐墩果酸和熊果酸含量的方法。方法采用HPLC色谱法，色谱柱为SilGreen C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；以甲醇-0.2%乙酸铵水溶液（85∶15）为流动相，检测波长为210 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为30℃。结果齐墩果酸和熊果酸分别在0.02510～1.0041 mg/ml、0.02527～1.0109 mg/ml浓度范围内具有良好线性关系（r=0.99999），平均回收率分别为95.71% [相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）=0.92%，n=6]、96.19%（RSD=1.16%，n=6）。结论HPLC测定墓头回药材中齐墩果酸和熊果酸含量具有灵敏度高、快速、简便、专属性强、准确和重复性好等优点，可为墓头回药材质量控制标准的建立提供科学依据。

墓头回；齐墩果酸；熊果酸；高效液相色谱法；含量测定

墓头回别名箭头风、九头鸟、追风箭、脚汗草、臭脚跟等，为败酱科败酱属植物糙叶败酱或异叶败酱的根。除西藏、青海、新疆外，墓头回在我国大部分地区均有分布，其具有燥湿止带、收敛止血、清热解毒之功，主治赤白带下，泄泻痢疾，疮疡肿毒[1]。墓头回含挥发油、黄酮、皂苷、萜类等多种化学成分。主要有效成分为三萜皂苷类，其苷元有齐墩果酸、熊果酸[2]。临床药理活性证明，齐墩果酸、熊果酸都具有抗菌消炎、利尿抗水肿、抑制肿瘤细胞生长、保肝、降酶、抗糖化、抗氧化、提高机体免疫力作用[3-10]。目前，关于墓头回三萜皂苷成分含量测定的研究主要针对齐墩果酸和总皂苷[11,12]，且报道较少，尚未见关于墓头回中熊果酸含量测定的报道。本研究采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），首次建立了同时测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸两种成分的方法，为墓头回的质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料 安捷伦1260 型高效液相色谱仪，XSE205型电子天平（梅特勒-托利多公司），KQ-500E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），ZM200型超离心研磨仪（德国）。

齐墩果酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110709-201607），熊果酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110742-201622）；收集了不同购买地的墓头回样品，其药材均经镇江市食品药品监督检验中心中药室陈晓风老师鉴定。甲醇为色谱纯试剂，水为超纯化水，其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1色谱条件 色谱柱：SilGreen C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇-0.2%乙酸铵水溶液（85∶15）；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；检测波长：210 nm；进样量：20 μl。

1.2.2对照品溶液的配制 分别精密称取齐墩果酸和熊果酸对照品适量，加甲醇制成齐墩果酸浓度为1.0041 mg/ml、熊果酸浓度为1.0109 mg/ml的对照品溶液，作为储备液。临用时精密吸取适量各对照品溶液混匀，即得混合对照品溶液。

1.2.3供试品溶液的制备 取墓头回药材粉末（过4号筛）约4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 ml，超声提取60 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 ml溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，20 ml/次，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇20 ml，盐酸4 ml，水浴加热水解4 h,放冷，加水10 ml，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20 ml。合并三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.4方法学考察

1.2.4.1方法的专属性 将按上述方法配制的齐墩果酸、熊果酸混合对照品溶液及制备好的墓头回药材样品按1.2.1色谱条件进样，考察齐墩果酸和熊果酸色谱峰的情况，样品中是否有相应峰的出现及分离度是否良好。

1.2.4.2线性关系考察 分别精密吸取1.2.2项下齐墩果酸、熊果酸对照品储备液适量，分别依次稀释1、2、10、20、40倍，配制成齐墩果酸对照品浓度分别为：1.0041 mg/ml、0.5020 mg/ml、0.1004 mg/ml、0.0502 mg/ml、0.0251 mg/ml，熊果酸对照品浓度分别为：1.0109 mg/ml、0.5054 mg/ml、0.1011 mg/ml、0.0505 mg/ml、0.0253 mg/ml，进样20 μl，按1.2.1项色谱条件记录峰面积，以浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算得回归方程。

1.2.4.3精密度试验 精密吸取齐墩果酸浓度为0.1004 mg/ml、熊果酸浓度为0.0505 mg/ml的混合对照品溶液，按上述色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.4.4重复性试验 取同一批次墓头回样品（2号样品）6份，每份约4 g，分别精密称定，按照1.2.3项下操作，按上述色谱条件测定,计算墓头回样品中齐墩果酸和熊果酸的含量，算出RSD。

1.2.4.5稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24 h进样，记录峰面积，计算RSD，考察样品放置一段时间后的稳定性。

1.2.4.6加样回收率试验 取已知含量的墓头回样品（2号样品）6份，每份约2 g，精密称定，分别精密加入齐墩果酸和熊果酸对照品溶液适量，照1.2.3项下方法操作制备所需溶液，按上述色谱条件测定，计算回收率。

2 结 果

2.1方法的专属性 齐墩果酸、熊果酸对照品色谱峰保留时间与墓头回样品相应色谱峰保留时间一致，齐墩果酸、熊果酸分离度良好，无杂质峰干扰，见图1。

图1 对照品与墓头回药材中齐墩果酸和熊果酸的高效液相色谱图

2.2线性关系考察 齐墩果酸和熊果酸的回归方程分别为Y=490.36802X+11.88715（r=0.99999），Y=401.10999X+1.82674（r=0.99999），分别在0.0251～1.0041 mg/ml，0.0253～1.0109 mg/ml范围内，具有良好线性关系。

2.3精密度试验 按照1.2.4.3精密度试验的方法，齐墩果酸和熊果酸对照品6次峰面积的RSD分别为0.60%、0.80%。

2.4重复性试验 按照1.2.4.4重复性试验的方法，墓头回样品中齐墩果酸和熊果酸的RSD分别为1.10%、1.30%。

2.5稳定性试验 墓头回样品在24 h内具有良好的稳定性，齐墩果酸和熊果酸的峰面积RSD分别为1.30%、1.50%。

2.6加样回收率试验 如表1所示，齐墩果酸和熊果酸的平均回收率分别为95.71%（RSD=0.92%，n=6）、96.19%（RSD=1.16%，n=6）。

2.7样品测定 取所收集的墓头回样品，按供试品溶液制备方法制备供试液，按上述高效液相色谱条件测定，计算含量。如表2所示，不同购买地的墓头回样品中齐墩果酸、熊果酸的含量均相差较大。

表2 7 批不同购买地的墓头回样品含量测定结果

3 讨 论

3.1流动相的选择 齐墩果酸与熊果酸为同分异构体，分离测定较为困难[13]。本试验在参考了文献[14-17]的基础上对乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺这几种流动相系统进行了比较筛选，结果均未得到良好的分离，经反复试验，以甲醇-0.2%乙酸铵水溶液（85∶15）为流动相，齐墩果酸和熊果酸分离较好。

3.2提取方法的选择 笔者曾参考文献[18]，分别用甲醇和乙醇对样品进行超声1 h及回流2 h后进样，齐墩果酸和熊果酸无法有效分离；后改用盐酸水解的方法，分别对甲醇超声提取、回流提取、索氏回流提取3种提取方式进行了考察，结果表明，采用超声提取时，齐墩果酸和熊果酸的提取率最高，因此建立本文中的提取方法，经试验证实该方法简单易行。

笔者测定了7批不同购买地的墓头回样品的含量，发现不同购买地的墓头回药材中齐墩果酸和熊果酸的含量存在较大的差异，可能受种属、采摘时间、存放时间等因素的影响。总之，本试验首次建立同时测定墓头回药材中齐墩果酸和熊果酸含量的方法，具有准确可靠、重复性好、特征性强、方法简便等特点，对墓头回药材的质量评价具有重要的意义。

[1]程卫东，李 立.墓头回的研究进展[J].甘肃中医，2006，19（10）: 39-41.DOI: 10.3969/j.issn.1004-6852.2006.10.028.

[2]毛红梅，平欲晖，宗星星，等.HPLC同时测定败酱草中常春藤皂苷元、齐墩果酸和熊果酸的含量[J].中国实验方剂学杂质，2012，18（15）: 89-92.DOI: 10.13422/j.cnki.syfjx.2012.15.037.

[3]张一芳.败酱草研究进展[J]. 中药材，2009，32（1）:148-152.DOI：10.13863/j.issn1001-4454.2009.01.042.

[4]万 新，石晋丽，刘 勇，等.败酱属植物化学成分与药理作用[J].现代药物与临床，2006，21（2）: 53-59.DOI: 10.3969/j.issn.1674-5515.2006.02.002.

[5]Saravanan R，Viswanathan P，Pugalendi K V.Protective effect of ursolic acid on ethanol-mediated experimental liver damage in rats [J]. Life Sci，2006，78（7）: 713-718.DOI:10.1016/j.lfs.2005.05.060.

[6]Shao J W，Dai Y C，Xue J P，et al.In vitro and in vivo anticancer activity evaluation of ursolic acid derivatives [J]. Eur J Med Chem，2011，46（7）: 2652-2661. DOI: 10.1016/j.ejmech.2011.03.050.

[7]Huang D，Ding Y，Li Y，et al.Anti-tumor activity of a 3-oxo derivative of oleanolic acid [J]. Cancer Lett，2006，233（2）:289-296. DOI: 10.1016/j.canlet.2005.03.019.

[8]Wang Z H，Hsu C C，Huang C N，et al.Anti-glycative effects of oleanolic acid and ursolic acid in kidney of diabetic mice [J].Eur J Pharmacol，2010，628（1-3）): 255-260.DOI: 10.1016/j.ejphar.2009.11.019.

[9]Wang X，Ye X L，Liu R，et al.Antioxidant activities of oleanolic acid in vitro: possible role of Nrf2 and MAP kinases[J]. Chem Biol Interact, 2010, 184（3）: 328-337.DOI:10.1016/j.cbi.2010.01.034.

[10]张明发，沈雅琴.齐墩果酸和熊果酸保肝药理作用的研究进展[J]. 抗感染药学，2012, 9（1）：13-19. DOI:10.3969/j.issn.1672-7878.2012.01-004.

[11]曹艳萍, 李翠芹. RP-HPLC法测定墓头回中的齐墩果酸[J]. 中草药 , 2005, 36（5）: 764-766.DOI: 10.3321/j.issn:02 53-2670.2005.05.051.

[12]曹艳萍.植物墓头回中总皂甙的提取与含量测定[J]. 化学研究与应用, 2005, 17（4） : 529-530. DOI: 10.3969/j.issn.1004-1656.2005.04.029.

[13]周先明, 吕美红. 高效液相色谱法测定中草药中齐墩果酸熊果酸含量的应用进展[J]. 安徽医学, 2011, 32（11）：1950-1952. DOI: 10.3969/j.issn.1000-0399.2011.11.060.

[14]国家药典委员会. 中华人民共和国药典（2015年版一部）[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015: 250-251.

[15]吴蓓丽，谢晓梅，况作品，等.宣木瓜药材-饮片-提取物-配方颗粒的质量相关性分析[J].中国实验方剂学杂质，2016, 22（15）: 9-12. DOI: 10.13422/j.cnki.syfjx.2016 050009.

[16]谭冬明, 石相莉, 罗星晔, 等. 甜茶中齐墩果酸及熊果酸的检测方法的建立[J]. 食品研究与开发，2017，38（14）:155-160. DOI: 10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.033.

[17]权 红, 甄梓娟, 李连强, 等. 藏药匙叶翼首草中齐墩果酸及熊果酸的含量测定[J]. 中国现代中药, 2016, 18（6）:762-765. DOI: 10.13313/j.issn.1673-4890.2016.6.016.

[18]江苏省食品药品监督管理局.江苏省中药材标准[M]. 南京：江苏凤凰科学技术出版社，2016: 73-79.

Simultaneous determination of oleanolic acid and ursolic acid in P. heterophylla by HPLC

CHEN Yangfang1, ZHANG Linsong1, CHEN Xiaofeng1, and YAN Lili2. 1. Zhenjiang Institute for Food and Drug Control, Zhenjiang 212002,China; 2. Jiangsu EHAI Pharmaceutical CO., LTD., Xuzhou 221004, China

CHEN Yangfang, E-mail: 346300606@qq.com

ObjectiveThe objective of this study was to establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for simultaneous measuring of the concentration of oleanolic acid and ursolic acid in P. heterophylla.MethodsThe analysis was performed on a SilGreen C18(5 μm，4.6 mm×250 mm) chromatographic column with mobile phase consisting of methanol-0.2% ammonium acetate water(85∶15). The detected wavelength was set at 210 nm. The flow rate was 1.0 ml/min and the column temperature was at 30℃.ResultsThe linearity was good in the ranges of 0.02510～1.0041 mg/ml and 0.02527～1.0109 mg/ml respectively for oleanolic acid and ursolic acid(r=0.99999).The average recovery rates of oleanolic acid and ursolic acid were 95.71% [relative standard deviation (RSD=0.92%,n=6] and 96.19% (RSD=1.16%,n=6) respectively.ConclusionsThe method of HPLC features high sensitivity, time efficiency, simplicity, strong specificity, high accuracy and good repeatability, which can be used for the quality control of P. heterophylla.

R284.2

Key wordsP. heterophylla; oleanolic acid; ursolic acid; high performance liquid chromatography; content determination

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.11.008

1. 212002，江苏省镇江市食品药品监督检验中心；2. 221004 徐州，江苏颐海药业有限责任公司

陈杨芳，E-mail: 346300606@qq.com

（2017-08-28收稿2017-10-13修回）

（本文编辑 付 辉）

国际权威医学期刊《柳叶刀》聚焦创伤救治“中国模式”

近日，国际权威医学期刊《柳叶刀》 （Lancet）刊载了北京大学人民医院创伤骨科姜保国教授团队关于中国交通和公共卫生发展现状的综述类文章“中国交通和公共卫生：通往健康未来之路”（Transport and public health in China: the road to a healthy future）。这是继2015年《柳叶刀》刊登中国交通医学文章之后，再一次将目光聚焦到中国交通发展与严重创伤救治体系建设上。

研究表明，中国交通事故发生率高，且多为严重创伤，常涉及多器官、多系统的损伤，因此就需要多学科联合进行科学、规范的整体性救治。但是，在我国整体创伤救治中，存在着院前急救不规范、院前救治人员缺乏规范化培训等问题。该综述指出，随着城市路网的扩大和个人机动交通工具保有量的增加，应急响应系统及创伤救治系统的不完备使事故致伤风险进一步加剧，因此，亟待建立完善的道路交通事故创伤紧急救治系统。

姜保国教授于2005年创建了北京大学交通医学中心（现为北京大学创伤救治中心），并提出在我国建立“以综合医院为核心的闭环式区域性创伤救治体系”的创新核心理念，制定严重创伤救治规范及自主研发信息联动系统，率先提出在城市区域综合医院建立创伤救治团队替代独立创伤救治中心的新模式。在此框架下救治创伤患者7万余人，从根本上改变了中国严重创伤救治的现状和流程，使创伤平均救治时间缩短了50%，严重创伤救治的院内平均病死率下降了40%。

据了解，该严重创伤救治“中国模式”已申请并获得教育部中国创伤医学“十三五”规划“严重创伤区域性救治体系建设”项目课题立项，并授权成立“中国创伤救治联盟”。北京大学创伤救治中心、北京大学人民医院联合全国百余家大型医院启动了“安全中国，百县工程”，该工程在以全国超过100个县域为主的城市建立区域性严重创伤救治体系，带动县域医疗卫生服务水平和公共卫生应急能力的提升，让更多基层百姓受益。

（宋昕）