油菜秸秆高温水解液中单糖组分的高效液相色谱测定

冯广荣， 鲁厚芳， 梁 斌， 刘颖颖

(1. 四川大学 化学工程学院， 四川 成都 610065； 2. 四川大学 新能源与低碳技术研究院， 四川 成都 610065)

研究报告—生物质化学品

油菜秸秆高温水解液中单糖组分的高效液相色谱测定

冯广荣1,2， 鲁厚芳1,2， 梁 斌1,2， 刘颖颖2*

(1. 四川大学 化学工程学院， 四川 成都 610065； 2. 四川大学 新能源与低碳技术研究院， 四川 成都 610065)

建立了高温水中CO2催化油菜秸秆水解体系中单糖的高效液相色谱(HPLC)分析的方法。其分析采用PrevailTMES糖柱，蒸发光散射检测器(ELSD)，流动相为乙腈/水(体积比80∶20)，等度洗脱，流速0.8 mL/min，柱温35 ℃，漂移管温度95 ℃，干燥空气作为载气，流速为3.0 L/min。20 min内阿拉伯糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖6种单糖得到了较好的分离，各物质线性回归方程的相关系数R2为0.999 1～0.999 7，其平均回收率为95.3 %～108.0 %，相对标准偏差(RSD)均小于3 %。

高效液相色谱;蒸发光散射检测器;秸秆水解液;单糖

随着化石能源的日益枯竭及其燃烧带来的环境污染日益严重，生物质能以其储量丰富、可再生和清洁环保等优点得到了高度重视，生物质高品位能源化已成为研究热点[1]。将农林废弃物中的木质纤维素类生物质水解生成糖再将其转化成乙醇等液体燃料[2-5]，将极大程度缓解全球的能源危机，而生物质水解生成糖是生物质能源制备过程中极为关键的一步。木质纤维素生物质水解方法主要有酶催化[6]和酸催化[7-8]，而酶催化存在生产费用昂贵、水解周期长等问题，酸催化则有对设备要求高、废酸回收利用难等问题，于是，超临界CO2和水因无毒无腐蚀、化学性质稳定且来源充足易得的优点，成为了人们关注的热点[9-11]。若要充分合理地应用生物质水解液，需对其糖组分进行准确的分析。目前，糖类的检测方法主要有比色法[12]、气相色谱[13]和液相色谱(HPLC)法[14-15]，其中采用HPLC法，样品无需进行衍生等处理，可直接准确测定每种单糖的含量。在HPLC方法中，单糖的检测多采用蒸发光散射检测器(ELSD)，林慧等[16]建立了HPLC-ELSD测定食品中果糖、葡萄糖、蔗糖等10种糖的分析方法；程勇等[17]建立了HPLC-ELSD测定烟草超声萃取液中的木糖、果糖、葡萄糖等水溶性糖的分析方法；Filson等[18]采用流动相梯度洗脱，建立了HPLC-ELSD法测定了纸浆酶水解液中的阿拉伯糖、木糖、葡萄糖等糖。尽管已建立一些HPLC方法测定糖含量，但不同体系水解液成分差别较大。生物质的高温液态水中CO2催化水解体系组分复杂，可能含有阿拉伯糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖等单糖，还有低聚糖、糠醛、5-羟甲基糠醛及金属离子等其他组分，而这些物质的存在均会对单糖的测定产生干扰，因此，建立适用于此水解体系中单糖测定的HPLC方法显得十分必要。本研究针对生物质水解液中可能存在的阿拉伯糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖等6种单糖建立了相应的HPLC-ELSD分析方法，测定6种单糖的含量，并对秸秆水解液产物作定性定量分析，进而了解水解液的组成，计算水解单糖得率，以期为生物质水解液的后续应用提供指导。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Alltech 1510高效液相色谱仪(配有XWK-Ⅲ无油空气泵)，天津市津分分析仪器制造有限公司；柱温箱AT-550，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器(ELSD)；PrevailTMES糖柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Sep-pak-C18固相萃取小柱，迪马科技；TDL-5-A型离心机，上海安亭科学仪器厂；UPH-I-10T型优普超纯水机；SX-2型搅拌球磨机，无锡新光粉体加工工艺有限公司。

油菜秸秆，收集于成都地区附近某农场，主要组分纤维素、半纤维素、木质素的质量分数分别为35.7 %、19.3 %、18.9 %。阿拉伯糖(gt;98 %)、木糖(gt;99.8 %)、果糖(生化试剂级)、甘露糖(gt;99.9 %)、半乳糖(gt;99 %)和葡萄糖(gt;99.8 %)；乙腈(色谱纯)；乙酸(gt;98 %)。

1.2 标准溶液的配制

分别精确称取阿拉伯糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖6种单糖标样于25 mL容量瓶中，用纯水稀释定容，得质量浓度分别为5.0、1.0、2.0、5.0、5.0、0.5 g/L的6种单糖混合标准溶液。

分别配制木糖、果糖、甘露糖和葡萄糖的标准溶液，质量浓度为5.0、1.0、10.0、5.0 g/L。精密移取这4种标准溶液置于25 mL容量瓶中，用纯水稀释定容，依次增大移取量，得到6个具有一定浓度梯度的4种单糖混合标准溶液，如表1所示。

表1 混合标准溶液中各单糖质量浓度

1.3 油菜秸秆水解液的制备

取30.00 g经粉碎烘干的油菜秸秆，在球料比(磨球和原料质量比)30∶1、转速450 r/min的条件下在搅拌球磨机中球磨活化2 h[19]，烘干后取5.00 g于高压釜中，加入150 mL纯水，在180 ℃条件下，通入CO2气体至压力达到8 MPa，水解1 h得油菜秸秆水解液[11]。对水解液进行抽滤，离心分离，取5 mL上清液通过预活化好的Sep-pak C18固相萃取小柱，弃去最初的2 mL，收集后面的3 mL[20]，再用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液供液相色谱分析用。

1.4 色谱条件

单糖的液相色谱分析采用PrevailTMES糖柱，配有柱温箱，流动相为乙腈/水，ELSD检测器，干燥空气作为载气，撞击器关，进样量为10 μL。

PrevailTMES糖柱填充了耐用的亲水性高分子凝胶，没有柱流失，且对流动相及样品pH值没有严格要求，在2～13均可，主要用于液相色谱分析单糖和寡糖。与氨基键合硅胶柱相比，可提供相当的分离度和更好的重现性和稳定性，因此，选用PrevailTMES糖柱检测油菜秸秆水解液中的单糖。

影响单糖色谱出峰的因素主要有流动相比例及流速、柱温及ELSD的参数(漂移管温度和载气流速)，对其进行优化得到分离度较好的液相色谱条件。对于采用的PrevailTMES糖柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相流速一般为0.5～1.0 mL/min，操作温度通常应该在4～50 ℃范围内。ELSD的载气选择干燥空气，流速范围为1.0～4.0 L/min。故优化分析条件时，各因素分别设置了3个水平，样品为1.2节中的6种糖混合标准溶液，根据色谱图选出较优参数。

1.5 油菜秸秆主要组分含量及其水解单糖得率的测定

油菜秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素3组分构成，其中纤维素和木质素含量通过重铬酸钾氧化法测定，半纤维素通过铜-碘法测定[21]。油菜秸秆高温水解单糖得率的计算公式如下：

Y=cV/m×100 %

式中：Y—单糖得率，%；c—水解液中单糖的质量浓度，g/L；V—水解液的体积，L；m—油菜秸秆中各种糖基的质量，即纤维素和半纤维素的总质量，g。

2 结果与讨论

2.1 单糖色谱条件的选择

2.1.1流动相的比例 流动相所用溶剂及其比例的变化会带来流动相的溶剂极性的变化，影响溶剂的洗脱能力，进而影响色谱峰的保留时间和响应值。HPLC-ELSD测单糖时，流动相选择乙腈/水要优于常用的甲醇/水[22]，乙腈的极性小于甲醇的极性，选用乙腈/水，调节其比例，可显著地影响溶剂极性及其洗脱能力，进而改善出峰情况。在流动相流速0.8 mL/min、柱温35 ℃、漂移管温度95 ℃、载气流速3.0 L/min的条件下，调节乙腈/水体积比为75∶25、80∶20、85∶15，分别进样，进样量均为10 μL，色谱图如图1所示。

图1 不同乙腈/水比例下的HPLC图Fig. 1 HPLC of mixed monosaccharide standards under different ratio of acetonitrile/water

由图1可知，当V(乙腈)∶V(水)=75∶25时，分析时间短，响应信号较大，但峰有重叠；当体积比为85∶15时，分析时间长，响应信号很弱，6种单糖只出现了2个峰，相应检测限增大；当体积比为80∶20时，6种单糖的峰能够得到很好的分离，且响应信号适中。可知，流动相中乙腈/水的比例会同时影响分离度、保留时间和响应值。当流动相中水较多时，单糖在流动相中的溶解能力强，流动相更容易将吸附在固定相上的单糖溶解并带走，加快了单糖在色谱柱上的吸附-解吸-再吸附-再解吸的过程，导致单糖组分能更快地流出，使保留时间缩短，减少样品分析时间，但若水过多，各单糖组分峰将会相互靠近，导致阿拉伯糖与木糖、半乳糖与葡萄糖的峰会有部分重叠，同时也不利于流动相在漂移管内的气化，使基线噪音增大。结合图1，选择适宜流动相比例V(乙腈)∶V(水)=80∶20。

2.1.2流动相的流速 根据范德姆特方程H=A+B/u+C·u(式中A、B、C对特定样品化合物及实验条件为常数，H为塔板高度，u为流动相流速)可知，流动相的流速会影响色谱柱的塔板高度及塔板数，进而影响分离度和保留时间[23]，且流速过大或过小均得不到较好的分离度。在流动相为V(乙腈)∶V(水)=80∶20、柱温35 ℃、漂移管温度95 ℃、载气流速3.0 L/min的条件下，调节流动相流速为0.6、0.8和1.0 mL/min，分别进样，色谱图如图2所示。由图2可知，当流速为0.6 mL/min时，各峰基本能分开，但响应值很小，得到响应值适中的峰要配制浓度较大的样品；当流速为1.0 mL/min时，保留时间小，分析时间短，但峰有重叠，不能达到很好的分离；而当流速为0.8 mL/min时，各峰能得到很好的分离，且响应值适中。流速变大，洗脱能力增强，保留时间缩短，但流速过大会导致由于色谱柱固定相与流动相传质存在着阻力引起的峰展宽；流速变小，洗脱能力减弱，保留时间延长，但流速过小会导致色谱柱内各部分存在浓度差而引起的纵向扩散带来的峰展宽，都不利于色谱峰的分离。结合图2，选择适宜流动相流速为0.8 mL/min。

图2 不同流动相流速下的HPLC图Fig. 2 HPLC of mixed monosaccharide standards under different flow rates of mobile phase

2.1.3柱温 待测组分在色谱柱上是一个吸附解吸动态平衡的过程，温度的改变会打破其平衡，建立新的平衡，改变温度将会影响保留时间和分离度。在流动相为V(乙腈)∶V(水)=80∶20、流速0.8 mL/min、漂移管温度95 ℃、载气流速3.0 L/min的条件下，柱温25、30、35 ℃的情况下分别进样，比较出峰情况，色谱图如图3所示。

图3 不同柱温下的HPLC图Fig. 3 HPLC of mixed monosaccharide standards under different column temperatures

随着柱温的升高，各组分在色谱柱内的保留时间均缩短，但总体变化不大。升高温度通常会使峰宽变窄，各峰更容易达到分离。当柱温为35 ℃时，各组分峰能完全分离，故选择适宜柱温为35 ℃。

2.1.4ELSD参数 漂移管温度和载气流速是ELSD检测器的2个重要参数，建立适当的分析方法需要对这2个参数进行优化。漂移管温度较低会导致流动相不能充分挥发，较高会使流动相沸腾，这都会降低信噪比。载气流速越小，形成的物质粒子半径越大，对激光的散射能力越强，相应的响应信号越大，但是并不是载气流速越小越好，因为当载气流速太小时，流动相不能完全挥发，同样会降低信噪比。

优化漂移管温度的依据是恰好能使流动相充分挥发，流动相中乙腈/水的比例决定了其沸点，据此确定了适宜的漂移管温度为95 ℃，载气流速为3.0 L/min。

最终确定测定单糖较优的液相条件为：柱子采用PrevailTMES糖柱，柱温35 ℃，流动相为乙腈/水(体积比80∶20)，流动相流速0.8 mL/min，ELSD检测器，漂移管温度95 ℃，载气为干燥空气，载气流速3.0 L/min，撞击器关。

2.2 单糖液相色谱方法的验证

2.2.1待测样品中糖成分的确定 取6种单糖的混合标准品和油菜秸秆水解液待测样品，在上述优化出来的液相色谱分析条件下分别进样，色谱图如图4所示。

图4 标准品和样品的HPLC图Fig. 4 HPLC of mixed monosaccharide standards and sample

从图中对比可知油菜秸秆水解液中含有木糖、果糖、甘露糖和葡萄糖。图4(b)中保留时间为4 min左右的色谱峰，是水解液中非糖物质出的峰，这些物质在PrevailTMES糖柱中不能得到很好的洗脱分离，色谱峰出现重叠，若要分析这些物质，需选用合适的色谱柱和检测器[24]。对于上述优化出来的单糖的液相色谱分析条件，在其方法验证实验中，仅针对样品中存在的4种单糖进行。

2.2.2标准曲线、线性范围及检测限 取木糖、果糖、甘露糖和葡萄糖4种单糖的6个混合标准溶液，分别重复进样3次，峰面积(S)取平均值，以lgS对lgc进行线性回归(其中c为糖质量浓度)，得到木糖、果糖、甘露糖和葡萄糖的线性回归方程和相关系数R2，检测限(LOD)按3倍的信噪比计算。根据实验得4种单糖的线性回归方程、相关系数、线性范围及检测限，结果见表2。其中重复进样的RSD均小于3 %。R2gt;0.999，表明线性关系良好。

表2 单糖的线性回归方程、R2、线性范围及检测限

2.2.3精密度实验 取木糖、果糖、甘露糖和葡萄糖4种单糖的混合标准溶液，重复进样5次，测定各组分的峰面积并计算相对标准偏差，结果见表3。RSD均小于3 %，表明该方法精密度良好。

表3 单糖的精密度实验结果

2.2.4重现性实验 取同一待测样品油菜秸秆水解液按1.3节相同的样品预处理方法制备成5份，分别进样，得峰面积及其相对标准偏差，结果见表4。RSD均小于3 %，表明该方法重现性良好。

表4 单糖的重现性实验结果

2.2.5回收率实验 采用加标回收法，取油菜秸秆水解液两份，一份精确加入木糖、果糖、甘露糖和葡萄糖，另一份不加。同一样品平行测定3次(RSD均小于3 %)，计算回收率，结果见表5。可知，4种单糖的平均回收率均符合要求，说明该方法具有很好的准确度。

表5 单糖的回收率实验结果

2.3 油菜秸秆水解液中单糖的测定

取相同的油菜秸秆原料，采用不同的球磨转速对其进行前处理，其他条件见1.3节，得不同前处理条件下的秸秆水解液。在优化出来的液相色谱条件下，分别进样，根据峰面积和线性拟合方程得各单糖质量浓度，进而计算出单糖得率，结果见表6。由表6可知，水解液中木糖、果糖、甘露糖和葡萄糖的含量以及单糖得率变化规律基本上和球磨活化强度保持一致。随着球磨活化强度的增加，纤维素的结晶度减小，有利于水解，葡萄糖及其同分异构体果糖、甘露糖的质量浓度都呈现增大趋势，且球磨转速为450 r/min时，单糖质量浓度最大，且得率最大，这与优化出来的球磨活化条件一致[19]。半纤维素较纤维素易于水解，球磨条件对其水解影响不大，其水解得来的木糖质量浓度变化不大，还略有减小，这是由于随着球磨强度的增加，木糖会发生降解生成糠醛。不同球磨条件下各组分质量浓度的变化也进一步印证该分析方法的可靠性和准确性。

表6 秸秆水解液中各单糖质量浓度及单糖得率

3 结 论

建立了测定油菜秸秆高温水解液中阿拉伯糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的HPLC-ELSD方法。采用PrevailTMES糖柱，流动相为乙腈/水(体积比80∶20)，等度洗脱，流速0.8 mL/min，柱温35 ℃，ELSD检测器，漂移管温度95 ℃，干燥空气作为载气，流速为3.0 L/min。20 min内6种单糖得到了较好的分离，各物质线性回归方程相关系数R2为0.999 1～0.999 7，其中平均回收率为95.30%～108.0%，相对标准偏差(RSD)均小于3%。此分析方法精密度、准确度高，重现性好，可用于生物质水解液中单糖含量及其得率的测定，是后续水解液利用的依据。

[1]卫新来,汪志,阮仁祥，等. 木质纤维素生物质降解产物的化学转化研究进展[J]. 现代化工，2010，30(12):26-31.

[2]SUN Y,CHENG J Y. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: A review[J]. Bioresource Technology,2002，83(1)：1-11.

[3]ALONSO D M，BOND J Q,DUMESIC J A. Catalytic conversion of biomass to biofuels[J]. Green Chemistry,2010,12(9)：1493-1513.

[4]GUPTA A,VERMA J P. Sustainable bio-ethanol production from agro-residues: A review[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews,2015,41：550-567.

[5]BAEYENS J,KANG Q,APPELS L,et al. Challenges and opportunities in improving the production of bio-ethanol[J]. Progress in Energy and Combustion Science,2015,47：60-88.

[6]张名佳,苏荣欣,齐崴,等. 木质纤维素酶解糖化[J]. 化学进展,2009,21(5)：1070-1074.

[7]LEE J W,JEFFRIES T W. Efficiencies of acid catalysts in the hydrolysis of lignocellulosic biomass over a range of combined severity factors[J].Bioresource Technology,2011,102(10)：5884-5890.

[8]徐明忠,庄新姝,袁振宏,等. 木质纤维素类生物质稀酸水解技术研究进展[J]. 可再生能源,2008,26(3)：43-47.

[9]GAO M,XU F,LI S R,et al. Effect of SC-CO2pretreatment in increasing rice straw biomass conversion[J]. Biosystems Engineering,2010,106(4)：470-475.

[10]NARAYANASWAMY N,FAIK A,GOETZ D J,et al. Supercritical carbon dioxide pretreatment of corn stover and switchgrass for lignocellulosic ethanol production[J]. Bioresource Technology,2011,102(13)：6995-7000.

[11]ZHAO P,LU H F,LIU S J,et al. Effect of carbon dioxide on the liquid hot-water treatment of lignocellulosics[J]. Journal of Biobased Materials and Bioenergy,2015,9(3)：334-341.

[12]赵凯,许鹏举,谷广烨. 3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究[J]. 食品科学,2008,29(8)：534-536.

[13]任美玲,吕兆林,欧阳呓林,等. 气相色谱柱前衍生化测定竹叶多糖超临界CO2提取物[J]. 食品科学,2012,33(6)：215-219.

[14]PANG T,BAI C M,XU Y J,et al. Determination of sugars in tobacco leaf by HPLC with evaporative light scattering detection[J]. Journal of Liquid Chromatography amp; Related Technologies,2006,29(9)：1281-1289.

[15]AGBLEVOR F A,HAMES B R,SCHELL D,et al. Analysis of biomass sugars using a novel HPLC method[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2007,136(3)：309-326.

[16]林慧,颜春荣,徐春祥,等. HPLC-ELSD法同时测定食品中的10种糖和糖醇[J]. 食品科学,2013,34(12)：286-291.

[17]程勇,李庆廷,李剑政,等. Prevail糖柱-HPLC-ELSD法测定烟草中水溶性糖[J]. 烟草科技,2010(3)：32-37.

[18]FILSON P B,DAWSON-ANDOH B E. Characterization of sugars from model and enzyme-mediated pulp hydrolyzates using high-performance liquid chromatography coupled to evaporative light scattering detection[J]. Bioresource Technology,2009,100(24)：6661- 6664.

[19]YUAN X L,LIU S J,FENG G R,et al. Effects of ball milling on structural changes and hydrolysis of lignocellulosic biomass in liquid hot-water compressed carbon dioxide[J].Korean Journal of Chemical Engineering,2016,33(7):2134-2141.

[20]杨俊,刘江生,蔡继宝,等. 高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定烟草中的水溶性糖[J]. 分析化学,2005,33(11)：1596-1598.

[21]杜瑛. 毛竹的主要成分分析及催化热解研究[D]. 成都：四川大学硕士学位论文,2005.

[22]郑春英,李庆勇,祖元刚. HPLC-ELSD法测定甘草中单糖的含量[J]. 东北林业大学学报,2006,34(2)：109-110.

[23]森德尔 L R,柯克兰 J J,格莱吉克 J L. 实用高效液相色谱法的建立[M]. 2版. 张玉奎,王杰,张维冰,译. 北京：华文出版社,2001：28-50.

[24]庄新姝,王树荣,袁振宏,等. 纤维素超低酸水解产物的分析[J]. 农业工程学报,2007,23(2)：177-182.

Determination of Monosaccharides in High Temperature Hydrolysate of Rape Straw by High Performance Liquid Chromatography

FENG Guangrong1,2, LU Houfang1,2, LIANG Bin1,2, LIU Yingying2

(1. College of Chemical Engineering,Sichuan University, Chengdu 610065, China;2. Institute of New Energy and Low Carbon Technology, Chengdu 610065, China)

The method was developed to determine monosaccharides in the high temperature hydrolysate of rape straw catalyzed by CO2via high performance liquid chromatography(HPLC). The monosaccharides were separated on the PrevailTMES carbohydrate column at 35 ℃ with the mixture of acetonitrile/water(80∶20,volume ratio) as mobile phase, which was under isocratic elution at the flow rate of 0.8 mL/min. They were detected by evaporative light-scattering detector(ELSD) using dry air as carrier gas at flow rate of 3.0 L/min and drift tube working at 95 ℃. The HPLC analysis method could ensure six monosaccharides(including arabinose, xylose, fructose, mannose, galactose and glucose) separate well within 20 min. The resultant correlation coefficients(R2) of monosaccharides were 0.999 1-0.999 7. The average recovery values were 95.3 %-108.0 %, and the relative standard deviation percentage(RSD) was less than 3 %.

high performance liquid chromatography;evaporative light-scattering detector;straw hydrolysate;monosaccharide

TQ35

A

1673-5854(2017)06- 0026- 07

10.3969/j.issn.1673-5854.2017.06.005

2016-10- 27

国家自然科学基金资助项目(21336008)

冯广荣(1988— )，女，河南安阳人，硕士生，主要从事生物质水解方法及其水解液组成的研究

*

刘颖颖，助理研究员，博士，研究方向为生物质能的开发；E-mailliuyingying@scu.edu.cn。