沙利度胺抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎与促进Treg细胞中枢募集有关

王赵伟 厉芳 吴承龙 肖桂荣 钟芳芳

沙利度胺抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎与促进Treg细胞中枢募集有关

王赵伟 厉芳 吴承龙 肖桂荣 钟芳芳

目的 研究沙利度胺对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的治疗作用及神经免疫机制。 方法 采用豚鼠脊髓匀浆免疫诱导SD大鼠制作EAE模型。在免疫诱导当天开始，分别给予15、30、60mg/kg沙利度胺，溶剂组给予无菌溶剂，空白对照组不予给药，每日监测行为学评分，至免疫诱导的第20天统一处死。常规病理染色检测中枢炎症水平，流式细胞术检测中枢CD4+T细胞浸润水平以及CD4+CD25+Treg细胞比例，Elisa检测血清INF-γ与TNF-α蛋白浓度。 结果 与溶剂组比较，给予15mg/kg沙利度胺大鼠EAE行为学评分、中枢炎症程度、CD4+T淋巴细胞浸润水平，血清INF-γ浓度均有下降趋势但差异无统计学意义（P＞0.05），而TNF-α浓度下降差异有统计学意义（P＜0.05）。给予30、60mg/kg沙利度胺均可使行为学评分下降，中枢炎症减轻，中枢CD4+T细胞浸润减少，血清INF-γ，TNF-α浓度降低。流式细胞术还发现沙利度胺可促进中枢Treg比例上调，差异有统计学意义。 结论 沙利度胺对大鼠EAE的治疗作用可能与促进Treg细胞向中枢募集有关。

沙利度胺 多发性硬化 实验性自身免疫性脑脊髓炎 调节性T细胞

多发性硬化是临床常见的中枢神经系统脱髓鞘疾病[1]。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化的经典动物模型。多发性硬化与EAE的炎症病灶均被发现存在致病性CD4+T细胞和调节性T细胞（Treg）[2-3]。调节性T细胞对于疾病恢复起关键作用。尽管已有多个修饰性治疗新药上市，但是疗效不够理想[4]。沙利度胺作为免疫调节作用的经典药物，近来发现对多种恶性肿瘤及自身免疫性疾病有效[5-7]。尽管确切药理作用机制还不明[8]，但不良反应小且价格低廉，将其开发为治疗药物具有重要意义。本研究主要探讨沙利度胺对于EAE的疗效及相关神经免疫机制，为后续临床研究提供动物实验基础和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性 SD大鼠45只，11～12周龄，体重（448.5±24.3）g；豚鼠 14 只，雌雄不拘，10～12 周龄，均购自上海斯莱克实验动物有限公司；沙利度胺（批号：T144-1G）、完全弗氏佐剂（批号：F5881-6X10ml）、Percoll液（批号：P4937-500ml）均购自美国 Sigma-Aldrich公司；INF-γ（批号：RIF00）与 TNF-α（批号：RTA00）Elisa试剂盒购自上海安迪生物科技有限公司；别藻青蛋白（APC）标记的CD4抗体（批号：17-0040-82）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD3抗体（批号：11-0030-82）、藻红蛋白（PE）标记的CD25抗体（批号：12-0390-82）购自美国eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理 将45只SD大鼠分为5个实验组，即溶剂组、15mg/kg组、30mg/kg组、60mg/kg组（每组10只）、空白对照组（5只）。除空白对照组采用0.9%氯化钠溶液与完全弗氏佐剂的混合乳剂免疫诱导外，其余4组均按EAE模型制作方法处理。4组中，溶剂组腹腔注射2%二甲基亚砜溶液，其余3组分别腹腔注射沙利度胺 15、30、60mg/kg。

1.2.2 EAE模型制作 参考文献[9-10]及我们前期造模方法：所有豚鼠先采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，再用0.9%氯化钠溶液左心室灌注处死并迅速剥离脊髓组织，加入等质量0.9%氯化钠溶液后于玻璃匀浆器内进行充分匀浆，再加入等体积完全弗氏佐剂后用注射器反复抽打成油包水乳剂（0.4ml/只）。于SD大鼠四肢足垫皮下注射上述乳剂，即刻以及48h后，各腹腔注射1次百日咳毒素（均1ml）。造模当天计为第0天（d0）。

1.2.3 沙利度胺给药 沙利度胺先用二甲基亚砜溶解，再用0.9%氯化钠溶液稀释，最终溶液含二甲基亚砜2%，沙利度胺浓度为90mg/ml。在d0开始用微量注射器腹腔注射方式给药，连续15d，1次/d。

1.2.4 行为学评分 在d0～d20每日行为学评分，评分标准参考文献[10]：无明显异常：0分；尾巴无力：1分；轻微后肢无力：2分；严重后肢麻痹：3分；四肢麻痹：4分；濒死或死亡：5分。在d0～d20各组大鼠每日行为学评分之和，计为累积评分，期间出现的最高行为学评分为最高评分。

1.2.5 常规病理检测 在d20采用10%水合氯醛麻醉5组大鼠，用左心室灌注0.9%氯化钠溶液的方法统一处死。剥离脑、脊髓组织，并在4%多聚甲醛中固定24 h，制成蜡块后切片，用HE染色。普通光学显微镜观察脑脊髓组织炎症情况。按照参考文献[11]标准进行评分：无

炎症变化：0分；炎症细胞浸润仅限于血管周围和脊膜周围：1分；脊髓内轻微的炎症细胞浸润（1～10个细胞/片）：2分；脊髓内中度的炎症细胞浸润（11～100个细胞/片）：3分；脊髓内严重的炎症细胞浸润（＞100个细胞/片）：4分。

1.2.6 脊髓单核细胞分离与流式细胞术检测 新鲜脊髓组织迅速用手术刀切碎，用Ⅳ型胶原酶消化45min，过滤后离心留取细胞沉淀，用不同浓度Percoll液离心获得脊髓单核细胞，将单核细胞悬液浓度调整为2×105/ml，加25μl悬液于Eppendrf管，加入APC标记的CD4抗体，FITC标记的CD3抗体，PE标记的CD25抗体各5μl，4℃冰箱避光反应 30min后上机（BD FACSAria）检测,用Flowjo7.6.1软件分析数据。

1.2.7 血清Elisa检测 5组大鼠分别于左心室取血，获得的血清标本用于INF-γ、TNF-α蛋白浓度检测。按照试剂盒说明书要求，Elisa试剂盒、待测血清标本达室温后进行检测。将标准液、稀释的血清标本用移液器移取到96孔板，移取抗体液等试剂到各孔后置摇床（500r/min）室温孵育2h，清空各孔液体后重复洗板2次，清空各孔内液体，并拍尽孔内残余液体，移取底物工作液等到各孔后室温孵育1h，移取终止液到各孔，上机检测光密度。最后根据光密度值拟合标准曲线来计算各标本浓度。1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 5统计软件，计量资料采用表示。日均行为学评分采用两因素多水平方差分析，其余组间比较采用单因素方差分析，多样本间比较有统计学差异者进一步采用Dunnet t检验作两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5组大鼠EAE发病情况及INF-γ、TNF-α水平比较 见表1。

由表1可见，60mg/kg组潜伏期大于溶剂组，差异有统计学意义（P＜0.05），60mg/kg组行为学最高学评分、累积评分、d11评分、d19评分、血清INF-γ与TNF-α浓度小于溶剂组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。30mg/kg组行为学最高评分、累积评分、d19评分、血清INF-γ与TNF-α小于溶剂组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。15mg/kg组血清TNF-α浓度小于与溶剂组，差异有统计学意义（P＜0.05）。15mg/kg组潜伏期、行为学评分、血清INF-γ浓度与与溶剂组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。各沙利度胺处理组发病率与溶剂组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 5组大鼠EAE发病期中枢炎症比较 见图1。

表1 5组大鼠EAE发病情况及INF-γ、TNF-α水平比较

图1 5 组大鼠 EAE 发病期中枢炎症比较[a：溶剂组；b：15mg/kg组；c：30mg/kg组；d:60mg/kg组；e：空白对照组（×200）]

由图1可见，溶剂组可见典型淋巴袖套形成，分布较多。15mg/kg组偶见典型淋巴袖套，单核细胞主要分布于脊髓膜下。30mg/kg及60mg/kg组较少见到典型淋巴袖套，炎性单核细胞主要分布于脊髓膜下，且数量较少。空白对照组脊髓HE染色病理切片中未见明显炎症细胞浸润。HE染色半定量分析显示，30mg/kg组[（1.60±0.84）分]及60mg/kg组[（1.30±0.95）分]评分低于溶剂组[（2.90±0.1.20）分]，差异有统计学意义（P＜0.05）。15mg/kg组[（2.401.27）分]与溶剂组比较评分有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 5组大鼠EAE发病期CD4+T、Treg细胞中枢募集水平比较 见图2、表2。

图 2 5 组大鼠 EAE 发病期 CD4+T、Treg细胞中枢募集水平比较（a：溶剂组 CD4+T；b：15mg/kg组 CD4+T；c：30mg/kg组 CD4+T；d：60mg/kg组 CD4+T；e：溶剂组 Treg细胞；f：60mg/kg组 Treg细胞）

由表2可见，15mg/kg组与溶剂组比较，CD4+T细胞比例、CD4+T数量有下降趋势，但差异无统计学意义，而30、60mg/kg组均有明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。进一步研究发现，60mg/kg组相对溶剂组中枢募集Treg细胞比例上调，差异有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

本研究发现，沙利度胺可延迟EAE疾病发作，减轻临床症状，抑制中枢炎症细胞浸润，减少炎症因子INF-γ、TNF-α释放。虽然已有沙利度胺抑制EAE的相关报道[12-13]，但我们进一步比较了不同剂量沙利度胺对EAE的治疗效应。本研究发现15mg/kg治疗剂量虽能有效抑制炎症因子TNF-α释放，但不能抑制SD大鼠EAE发病，但30mg/kg以及60mg/kg剂量均可抑制EAE发病。沙利度胺30mg/kg可能是起始有效剂量，而60mg/kg疗效更加明显。

表2 5组大鼠EAE发病期CD4+T、Treg细胞中枢募集水平比较

在多发性硬化或EAE发病过程中，CD4+T细胞是参与炎症调控机制的主要淋巴细胞亚型[2]。CD4+T细胞随着炎症启动从外周淋巴器官募集进入中枢，并释放各类炎症因子，刺激中枢吞噬细胞活化迁移，最终损伤少突胶质细胞甚至神经元轴突[4]。CD4+T细胞中枢募集水平是与中枢炎症程度成正比的。本研究通过HE染色经光学显微镜观察发现，溶剂组脊髓内含有广泛的单核淋巴细胞浸润，而30mg/kg和60mg/kg沙利度胺可明显抑制单核淋巴细胞浸润。进一步通过流式细胞术检测发现30mg/kg和60mg/kg沙利度胺不仅减少了CD4+T细胞向中枢浸润绝对数量，也降低了在中枢浸润淋巴细胞中的比例。沙利度胺通过减少CD4+T细胞分化激活，抑制其向中枢募集而实现EAE治疗作用。

MS/EAE疾病阶段可以观察到INF-γ、TNF-α等炎症介质水平上调，是反应炎症情况的观测指标[14]。在脱髓鞘炎症反应过程中INF-γ、TNF-α可以由致病性CD4+T细胞、巨噬细胞等免疫活性细胞释放，可促进炎症损伤。本研究发现30mg/kg和60mg/kg沙利度胺能抑制INF-γ、TNF-α蛋白浓度水平，但确切调节通路不明。

致病性CD4+T细胞激活、释放相关炎症介质的同时，Treg细胞也会分化激活，并向中枢炎症区募集，释放IL-10等免疫调控因子，抑制致病性CD4+T细胞继续激活和释放炎症介质[3]。临床研究发现MS患者存在Treg细胞分化激活功能受限，不能有效抑制中枢炎症反应[15]。本研究通过对中枢浸润CD4+T细胞亚型分析发现，沙利度胺可提高中枢Treg细胞比例。因此，沙利度胺可能通过促进Treg细胞亚型分化或促进Treg细胞从外周淋巴器官向中枢募集而抑制EAE。

总之，沙利度胺对多种自身免疫性疾病以及肿瘤性疾病有治疗效应[4,16-17]，不良反应少，且较为廉价。本项研究发现沙利度胺30mg/kg以上治疗剂量即可抑制SD大鼠EAE发病。而目前有效治疗MS的药物短缺[4]，利用沙利度胺或者开发出更加高效的结构类似物来治疗多发性硬化具有临床前景。

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Thalidomide alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis through promoting Treg cell recruitment in rats

WANG Zhaowei,LI Fang,WU Chenglong,et al.Department of Neurology,Shaoxing People'Hospital（Shaoxing Hospital of Zhejiang University）,Shaoxing 312000,China

Objective To investigate the effect of thalidomide on experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）in rats and its related mechanisms. Methods SD rates were injected with spinal cord homogenate of guinea pig(EAE group)or solvent(control group),then the rats were treated with thalidomide at different doses(15mg/kg,30mg/kg,60mg/kg).The clinic scores of EAE were assessed daily until animals were sacrificed.All rats were sacrificed at d20 after model induced and paraffin sections were prepared and stained with hematoxylin-eosin.Serum INF-γ and TNF-α levels were measured by ELISA.The spinal cord infiltrating CD4+T cells and CD4+CD25+T cells were determined by flow cytometry. Results Thalidomide 15mg/kg did not effectively reduce the severity of EAE,but reduced the TNF-α protein levels.Thalidomide 30mg/kg and 60mg/kg reduced the clinic score of EAE,the inflammation in the spinal cord,the number of infiltrating CD4+T cells and the INF-γ,TNF-α protein levels.And thalidomide 60mg/kg promoted CD4+CD25+T cell recruitment into central nervous system.Conclusion Thalidomide alleviated the severity of EAE in rats,which may be related to the promotion of CD4+CD25+T cell recruitment into central nervous system.

Thalidomide Multiple sclerosis EAE Treg cells

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.22.2016-2092

浙江省基础公益研究计划项目（LGF18H090018）；绍兴市人民医院青年科研基金项目（2017A10）

312000 绍兴市人民医院（浙江大学绍兴医院）神经内科（王赵伟、吴承龙、肖桂荣、钟芳芳）；杭州市萧山区第一医院神经内科（厉芳）

吴承龙，E-mail：wuchlo7666@126.com

2016-12-13）

杨丽）