自组装白蛋白纳米粒作为阿克拉霉素A递送载体

陈美惠，丁厚伟，张庆明，龚光明，朱 庆，王曙东

自组装白蛋白纳米粒作为阿克拉霉素A递送载体

陈美惠1，丁厚伟1，张庆明1，龚光明1，朱 庆2，王曙东1

目的本研究旨在通过阿克拉霉素(ACM)共价结合氨基氧乙酸(AOA)产生的活性中间体，以降低ACM毒性和提高靶向药物。方法采用三(2-羧乙基)膦(TCEP)作为二硫键断裂分子，通过分子间的“打开-中间-闭合”开关制备人血清白蛋白(HSA)的自组装纳米粒(Nanoparticle，NPs)。结果核磁共振氢谱(1H-NMR)分析表明ACM和AOA之间的结合发生在ACM的酮基(12C)位置。HSA纳米粒(NPs-ACM)负载ACM的载药量为7.4%。NPs-ACM的释放与pH相关。与游离ACM相比，NPs-ACM的细胞毒性和心脏毒性降低。体内研究表明，NPs-ACM对荷瘤小鼠靶向性比游离ACM高4倍(Plt;0.05)。结论纳米粒NPs-ACM前体药物是理想的ACM肿瘤靶向药物载体。

白蛋白；阿克拉霉素A；药物递送

阿克拉霉素(aclacinomycin，ACM)是来自于链霉菌属(Streptomyces galilaeus)的一种强效抗生素，有抑制拓扑异构酶II和拓扑异构酶I毒素的作用[1]。ACM可用于有效治疗多种人类恶性肿瘤。然而，ACM临床使用中的两个主要问题是导致心肌炎症和骨髓抑制[2]。药物输送系统(drug delivery systems,DDS)用以增强制剂抗肿瘤作用，减少其毒性，并显示出对肿瘤微环境的优势，引起了很大的关注[3]。不同的DDS，如乳剂、脂质体和磁性纳米粒均可作为ACM载体[4-5]。然而，静脉注射乳剂可在肝脏和脾脏被单核吞噬系统(MPS)迅速吞噬[6]。此外，脂质体的缺陷，如不稳定和复杂的制备工艺，限制了其应用。前药可增加母体化合物预期的治疗指数，同时以一种可控的方式降低其不利影响[7]。

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是一种多功能血浆蛋白，能将铁、药物和小分子输送到组织到身体各处。近年来，白蛋白因为其无免疫原性、生物降解性和丰度，已成为合适的候选药物载体[8]。HSA纳米粒通过增强的渗透性和保留效应(EPR)的被动靶向和通过gp60受体引起的主动靶向而具备双靶向功能[9]。以HSA为基础的DDS可以通过共价连接药物荧光探针以及暴露的活性基团或非共价组装，如交联和高压均质化被开发[10-11]。白蛋白的水化膜在去溶剂化法中易被破坏。ACM盐酸盐是水溶性的化学药品。因此，前药法是ACM制备DDS的一种合适的方法。各种交联剂，如二硫腙肽[12]，可以在母体药物释放的微环境被代谢。这些交联剂已用于DDS的制备肿瘤靶向化疗[13]。目前，缺乏ACM的前药递送系统。基于这些概念，本研究开发了氨基氧乙酸(AOA)为交联剂的HSA纳米粒(NPs-ACM)靶向递送系统。AOA通过C=N键耦联ACM，与TCEP为还原剂制备的HSA纳米粒形成NPs-ACM。用电喷雾电离质谱(ESI-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)、药物释放、高分辨电镜(HRTEM)、活体成像等方法对NPs-ACM进行了表征。

1 材料与方法

1.1主要材料 HSA，近红外797(NIR-797)和TCEP均购自Sigma Aldrich(圣路易斯，美国)。阿克拉霉素盐酸盐(98%，化学级)购自万乐药业有限公司(深圳，中国)，小鼠肛门纤维肉瘤细胞S180和乳腺癌细胞MCF-7购自上海博谷生物公司，ICR小鼠(SPF级,购自南通大学,许可证号：2008001683031。通风条件，室温25 ℃，自由采食)。

1.2实验方法

1.2.1合成AOA-ACM AOA-ACM和NPs-ACM的制备见图1。100 mg的ACM溶解在10 mL的5%葡萄糖溶液，37 ℃条件下，加入100 mg AOA。3 h后，用100 mL氯仿提取AOA-ACM，蒸发至干燥。在室温下，以四甲基硅烷作为内标，以Bruker AVANCE III光谱仪(400 MHz),1H-NMR分析ACM-AOA的结构。电喷雾质谱(ESI-M)定AOA-ACM的相对分子量。

①ACM；②AOA-ACM；③ACM中间体；④HSA；⑤TCEP还原的HSA分子暴露的疏水区域；⑥纳米白蛋白；⑦NPs-ACM纳米粒图1 AOA-ACM的合成和NPs-ACM纳米粒制备示意图

1.2.2NPs-HSA及NPs-ACM的制备 200 mg的HSA在37 ℃下溶解于50 mL Tris buffer(5 mmol/L，pH 7.4)，添加TCEP(5 mmol/L)。搅拌10 min制备纳米粒HSA。合成的纳米HSA与AOA-ACM结合。HSA蛋白粒子耦联AOA-ACM：2 mL二甲酰胺(DMF)溶解AOA-ACM(80 mg)，加入DCC(50 mg，0.225 mmol)和NHS(60 mg，0.51 mmol)。混合物在室温下搅拌8 h后0.45 μm小滤器(密理博公司产品)过滤，。上清液中加入HSA(200 mg)磷酸盐缓冲液(10 mL)进一步搅拌12 h。透析出去未结合的小分子后冻干。

1.2.3细胞摄取 异硫氰酸荧光素(FITC)标记NPs-ACM：20 mg的前药被溶解在2 mL碳酸氢盐缓冲液(0.05 M)，加入2 mg FITC。溶液在37 ℃孵育12 h，pH 7.4的PBS透析。MCF-7细胞(1×105)/孔接种到共聚焦培养板(生物科技，美国)后，培养24 h。用FITC标记的NPs-ACM，等量的ACM(1 μmol/L)分别共培养2 h和4 h。PBS清洗去除残留的FITC，并用400 μL 4，6-diamidino-2苯基吲哚(DAPI)染细胞核15 min，甲醇固定。奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察细胞。FITC和DAPI的激发(EX)波长和发射(EM)波长分别为490 nm和525 nm，358 nm和461 nm。

1.2.4ACM和NPs-ACM的细胞毒性和心脏毒性 培养24 h后，MCF-7和S180肿瘤细胞与ACM和NPs-ACM孵育(0.1 ～100 μmol/L，pH 7.4) 共孵育24 h。每孔加入 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(5 mg/mL)10 uL，37 ℃孵育4 h后，加入200 μL二甲亚砜(DMSO)溶解甲瓒晶体。采用分光光度法(570 nm)测定甲瓒吸光度。组织病理学法评价ACM 和NPs-ACM的心脏毒性。15只健康雄性ICR小鼠(22～25 g)分为3组，每组5只。ACM组和NPs-ACM组第1天、第3天和第5天，注射入6 mg/kg游离ACM和NPs-ACM，对照组注射等渗盐水。最后一次注射后4 d，剥离小鼠心脏，HE染色，并进行组织学分析。

1.2.5荷瘤小鼠模型的构建以及ACM和NPs-ACM的体内分布 200 uL S180细胞悬浮液(5×105细胞/mL，PBS稀释)注射至ICR小鼠左腋下，制备荷瘤小鼠模型。ACM和NPs-ACM按照6 mg/kg剂量静脉注射荷瘤小鼠。48 h后，处死小鼠，取瘤组织、心、肝、脾、肺和肾。对照组小鼠注射等渗盐水(0.1 mL/只)。用IVIS Spectum(Caliper，USA)成像系统分析，自发背景荧光利用软件进行抑扣除。激发波长425 nm，发射波长510 nm，评价ACM及前体药物在各器官的分布。

1.3统计学分析 用Excel进行数据统计分析，组间比较采用t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1合成AOA-ACM1H-NMR显示ACM可以通过其他的12C-酮基基团与小分子AOA反应形成AOA-ACM，见图2。ESI-MS显示AOA-ACM以正离子模式[M + H]形成离子峰，相对分子质量为m/z=885.42，见图3。

图2 AOA-ACM的核磁共振氢谱

图3 AOA-ACM的质谱图

2.2HSA蛋白与NPs-ACM外貌和大小 AOA-ACM与NPs-HSA粒子耦联形成NPs-ACM前药。HSA和NPs-ACM的半径和外貌见图4。两者分别为10～18 nm及30～90 nm的球形粒子。粒径100 nm可以获得较好的靶向性能[14]。

a：游离的HSA；b：NPs-ACM粒子

图4高分辨电镜观察粒子外貌和动态光散射察粒子大小

2.3NPs-ACM的载药量和体外释放 紫外吸光法测定NPs-ACM的载药量。HSA和ACM分别在280 nm和430 nm处具有吸收峰。纳米粒中的HSA含量为42.5 mg/mL (BCA试剂盒定量)，ACM浓度为3.06 mg/mL。载药率为3.06/42.5×100 = 7.4%。耦联物中，ACM与HAS的比例为6∶1。36 h内，pH5.0条件下，约60%的ACM从NPs-ACM释放,而pH 7.2条件下，只有10%左右。NPs-ACM的释放是依赖于酸不稳定C=N之间的连接ACM和AOA部分。见图5。

图5不同pH条件下ACM从NPs-ACM中累积释放

2.4NPs-ACM的体外细胞毒性和心脏毒性 结果显示，NPs-ACM相对于ACM的细胞毒下降，见图6。可能与NPs-ACM相对分子量比较大，ACM迅速扩散抑制肿瘤细胞生长有关。NPs-ACM释放ACM依赖于细胞内释放酸性环境，在发挥抗肿瘤活性方面有滞后性。NPs-ACM穿透细胞膜较慢，进入溶酶体后释放ACM，呈现对抗肿瘤细胞较低的细胞毒性。其IC50较ACM大。

MTT测定细胞半数抑制率(n=6)

图6 ACM和NPs-ACM对S180肿瘤细胞的体外细胞毒性

小鼠心脏组织病理分析结果显示：与对照组相比，ACM组心脏显示出了严重的空泡和嗜酸性病变，而NPs-ACM组与对照组无明显的细胞病变，见图7。显示纳米制剂对小鼠的心脏毒性显著下降，可能与选择性的肿瘤靶向有关。

2.5NPs-ACM细胞摄取 结果表明，NPs-ACM在MCF-7细胞质中的浓度增加具有时间依赖性(2 h到4 h)。见图8。

2.6ACM和NPs-ACM的体内分布 结果显示，NPs-ACM主要聚集于肿瘤和肝组织，在肝组织的荧光强度高于ACM，但差异无统计学意义(Pgt;0.05)。NPs-ACM对肿瘤的靶向性约为ACM的4倍(P= 0.023)。NPs-ACM的EPR效应以及在血液循环时间的延长可能是导致其对肿瘤靶向性的重要因素。见图9。

a：等渗盐水对照组; b：ACM组；c：NPs-ACM组

图7各组小鼠心脏组织病理形态(HE ×200)

图8 LSCM显示FITC标记的NPs-ACM在37 ℃下孵育2 h和4 h的MCF-7细胞

a:离体NIRF光学图像；b:荧光定量

荷瘤小鼠注射游离ACM和NPs-ACM后，各器官或组织携带小鼠荧光量比较(n=3)，*Plt;0.05

图9荷瘤小鼠ACM制剂的体内分布

3 讨 论

本研究提出了一种简便的方法，制备活性中间体和药理物质(含有酮基的ACM)靶向输送系统。AOA与ACM在酮基的12C位置发生耦联，随后结合NPs-HSA生成NPs-ACM前药，载药量为7.4%。NPs-ACM的释放依赖于pH。与游离ACM相比，NPs-ACM肿瘤靶向性大大提高,心脏毒性大大降低。因此，NPs-ACM是一种安全的、可注射的，有前景的用于肿瘤靶向的DDS。

[1] Nitiss JL，Pourquier P，Pommier Y. Aclacinomycin A stabilizes topoisomerase I covalent complexes[J]. Cancer Res，1997，57(20): 4564-4569.

[2] Ariji F，Shida K，Konno K，etal. Cardiotoxic study of aclacinomycin A. Subacute cardiotoxic effect of aclacinomycin A in rats (author's transl) [J].Jpn J Antibiot，1980，33(3): 281-293.

[3] 章 磊,流小舟,孙 畅,等.多途径靶向给药系统在骨肉瘤治疗中的研究进展[J]. 东南国防医药，2016，18(6)632-635.

[4] Shiokawa T，Hattori Y，Kawano K，etal. Effect of polyethylene glycol linker chain length of folate-linked microemulsions loading aclacinomycin A on targeting ability and antitumor effect in vitro and in vivo[J]. Clin Cancer Res，2005,11(5): 2018-2025.

[5] Wang J，Maitani Y，Takayama K. Antitumor effects and pharmacokinetics of aclacinomycin A carried by injectable emulsions composed of vitamin E，cholesterol，and PEG-lipid[J]. J Pharm Sci，2002，91(4):1128-1134.

[6] Jiang XH，Liao GT，Huang GQ，etal. The antihepatoma effect of lyophilized aclacinomycin A polyisobutylcyanoacrylate nanoparticles in vitro and in vivo[J].Yao Xue Xue Bao，1995，30(3):179-183.

[7] Wohl AR，Michel AR，Kalscheuer S,etal. Silicate esters of paclitaxel and docetaxel: synthesis，hydrophobicity，hydrolytic stability，cytotoxicity，and prodrug potential[J].J Med Chem，2014，57 (6)：2368-2379.

[8] Israel LL，Kovalenko EI，Boyko AA，etal.Towards hybrid biocompatible magnetic rHuman serum albumin-based nanoparticles: use of ultra-small (CeLn)3/4+ cation-doped maghemite nanoparticles as functional shell[J]. Nanotechnology，2015，26(4):045601.doi: 10.1088/0957-4484/26/4/045601.

[9] Kobayashi H，Watanabe R，Choyke PL. Improving conventional enhanced permeability and retention (EPR) effects; what is the appropriate target? [J] Theranostics，2014，4(1): 81-89.

[10] Wilson B，Ambika TV，Patel RD，etal.Nanoparticles based on albumin: preparation，characterization and the use for 5-flurouracil delivery[J].Int J Biol Macromol，2012， 51(5)： 874-878.

[11] Subia B，Kundu SC. Drug loading and release on tumor cells using silk fibroin-albumin nanoparticles as carriers[J]. Nanotechnology，2013，24(3)：035103. doi: 10.1088/0957-4484/24/3/035103.

[12] Kastl R，Wennemers H. Peptide-catalyzed stereoselective conjugate addition reactions generating all-carbon quaternary stereogenic centers[J].Angew Chem Int Ed Engl，2013，52 (28): 7228-7732.

[13] Kitamura I，Oki T，Inui T. A sensitive analytical method for aclacinomycin A and its analogs by thin-layer chromatography and fluorescence scanning[J]. J Antibiot (Tokyo)，1978,31(9):919-922.

[14] 龚光明，陈美惠，王曙东. 人血浆蛋白多烯紫杉醇纳米粒子的自组装及对肿瘤的靶向性[J].东南国防医药，2016，18(5)468-471.

2017-04-17；

2017-08-21)

(本文编辑：叶华珍； 英文编辑：王建东)

Self-assembledalbuminnanoparticlesasananocarrierforaclacinomycinA

CHEN Mei-hui1，DING Hou-wei1，ZHANG Qing-ming1，GONG Guang-ming1，ZHU Qing2，WANG Shu-dong1

(1.DepartmentofPharmaceuticalPreparation，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion，PLA，Nanjing210002，Jiangsu，China；2.CollegeofPharmacy，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，Jiangsu，China)

ObjectiveThis study aimed to reduce the cytotoxicity and improve the targeting of aclacinomycin (ACM) by covalently coupling it with amino-oxyacetic acid (AOA) to generate an active intermediate，AOA-ACM.MethodsAOA-ACM was conjugated with self-assembled human serum albumin (HSA) nanoparticles constructed using Tris (2-carboxyethy1) phosphine (TCEP) as disulfide bond breaking molecules.ResultsConjugation between ACM and albumin nanoparticles was found to occur at an ACM ketone site using 1H-NMR. The drug loading efficiency of ACM conjugated with HSA nanoparticles (NPs-ACM) was 7.4% (molar ratio=6:1). The release of NPs-ACM was pH dependent. The cytotoxicity and cardiotoxicity of NPs-ACM were reduced compared with the free ACM. Vivo studies indicated that NPs-ACM exhibited fourfold higher tumor targeting capability on S180-tumor-bearing mice compared with the free ACM (Plt;0.05).ConclusionThe NPs-ACM prodrug is ideal tumor targeting drug carriers for ACM.

Albumin；Aclacinomycin A；Drug delivery

R945

A

1672-271X(2017)06-0565-05

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.06.002

国家自然科学基金(31671026)

1.210002 南京，南京军区南京总医院制剂科；2.210023 南京，南京中医药大学药学院

王曙东，E-mail:sdwangpharm@126.com

陈美惠，丁厚伟，张庆明,等.自组装白蛋白纳米粒作为阿克拉霉素A递送载体[J].东南国防医药，2017,19(6):565-569.