抗雌激素治疗对耐酪氨酸激酶抑制剂非小细胞肺癌细胞株抗增殖作用的机制探讨

徐瑞彤，孙康俊，戴冠群，徐 静

抗雌激素治疗对耐酪氨酸激酶抑制剂非小细胞肺癌细胞株抗增殖作用的机制探讨

徐瑞彤1，孙康俊2，戴冠群1，徐 静3

目的探讨氟维司群逆转吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株耐药性的可能性及其机制。方法分别用不同浓度的氟维司群和吉非替尼，单药以及联合对非小细胞肺癌细胞株H1975[含表皮生长因子受体(EGFR) L858R amp; T790m突变]、H1650(含EGFR Del E746-A750 amp; PTEN De突变)、PC-9(含EGFR Del E746-A750突变)细胞进行干预后，采用MTT法检测细胞增殖变化，Western blot法检测EGFR、雌激素受体(ER)、磷酸化表皮生长因子受体(p-EGFR)的蛋白表达。结果①H1975、H1650、PC-9肺癌细胞中均有EGFR及ER表达；②吉非替尼及氟维司群联合用药较单药可明显抑制H1975、H1650、PC-9肺癌细胞的增殖(Plt;0.001)；③H1975耐药细胞株内T790m突变型EGFR的磷酸化水平可以快速地被雌激素升高或被氟维司群抑制；④ 在酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)获得性耐药的肺癌细胞株中雌激素、表皮生长因子(EGF)分别下调EGFR、ER的水平，氟维司群、吉非替尼分别上调EGFR、ER的水平。结论采用EGFR的靶向治疗与抗雌激素治疗相结合的治疗方案提高EGFR和ER阳性的EGFR-TKI获得性耐药的NSCLC的治疗效果在理论上是可行的。

氟维司群；吉非替尼；非小细胞肺癌；表皮生长因子受体；耐药

随着全球社会经济的快速发展，环境污染愈加严重，加上人口老龄化、不健康的生活方式等等，使得恶性肿瘤的发病率连年增长[1]。根据最新的统计数据，肺癌是影响我国居民健康的排名第一的恶性肿瘤,发病和死亡呈现逐年上升趋势[2]。目前对于肺癌的治疗有很多新的进展,其中针对肺癌发生发展的信号通路中各个靶点的分子靶向药物进一步提高了肿瘤的缓解率，降低了复发率，带来了可喜的疗效。而表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是现阶段研究最多的治疗靶点。EGFR是erbB/HER家族的成员之一，多在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)肿瘤组织中过表达(40%～80%)，并与预后不良相关[3]。EGFR信号通路激活后可启动下游多个与肿瘤细胞相关的信号级联反应，包括抑制细胞凋亡，促进细胞增殖、增强细胞侵袭性以及诱导血管生成等[4]。

吉非替尼和厄洛替尼作为酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的代表药物，结构类似ATP，可与EGFR-TK催化区域位点竞争性结合，从而阻断胞内外的信号传递，抑制肿瘤细胞的增殖和转移，目前已在全球范围内用于治疗晚期NSCLC[5]。前瞻性和回顾性研究结果显示，EGFR-TKI临床受益的预测因素包括女性、无吸烟史、腺癌、亚裔、治疗相关皮疹的严重程度、存在EGFR突变等[6-9]。约90%的NSCLC组织中存在基因突变，多表现为EGFR外显子19的缺失以及外显子21的替代突变，这两种突变都可以增加NSCLC对EGFR-EKI的敏感性[6,10-11]。虽然在这类患者中，使用吉非替尼或厄洛替尼后疾病可获得缓解，但是部分患者经过一段时间后，疾病可能会出现再次进展，中位时间为3～8个月，称为获得性耐药现象[12-14]。目前已知最常见的获得性耐药的分子机制为EGFR T790m二次突变[15]以及MET原癌基因扩增[16]。T790位于EGFR与ATP结合的关键区域，也称为“gatekeeper”残基。从临床获得的耐药患者的组织标本以及耐药的NSCLC细胞株的分子研究显示，T790m突变就是除一次活化性突变外，T790位点上出现以大量甲硫氨酸残基替代苏氨酸的二次替代突变，这种替代突变不影响EGFR的催化活性，因此有研究猜想大量的甲硫氨酸残基对EGFR-TKI的结合形成了位阻，影响其与EFFR激酶区的结合，从而产生获得性耐药[17]。

Stabile等[18]曾报道联合吉非替尼及抗雌激素药物氟维司群同时作用于NSCLC细胞的EGFR及雌激素受体(estrogen receptor ER)2个靶点，可较单药明显增强其抗肿瘤细胞增殖的作用；并证明吉非替尼可持续上调肺癌细胞内ER的表达。这提示我们在体内可能存在EGFR信号转导途径和雌激素信号通路的交叉，共同影响吉非替尼的活性和疗效。考虑EGFR-TKI使用的优势人群包括女性、腺癌[6-9]，并且用药治疗一段时间后经常会出现耐药现象[12-13,19]，我们推测这可能也是由于吉非替尼持续上调了肿瘤细胞内ER的表达水平，通过ER介导的其他途径补偿了被抑制的EGFR介导的信号通路，从而表现出耐药。本实验在细胞水平上比较了吉非替尼和氟维司群联合与单一用药对EGFR-TKI获得性耐药的NSCLC细胞生长的影响，并初步探讨了与之相关的ER/EGFR信号通路相互作用的分子机制，希望为EGFR-TKI获得性耐药的NSCLC的分子靶向治疗提供新的途径及理论支持。

1 材料与方法

1.1材料 非小细胞肺癌细胞株H1975(含EGFR L858R amp; T790m突变)采购自ATCC(United States)，H1650(含EGFR Del E746-A750 amp; PTEN De突变)由本实验室保存，PC-9(含EGFR Del E746-A750突变)由上海肺科医院周彩存教授赠送。药品吉非替尼购自Tocris公司(United Kingdom)，氟维司群及17β-雌二醇购自Cayman Chemical 公司(United States)。2种药品粉剂溶于DMSO(GIBCO公司)，加入RPMI1640培养基稀释成所需浓度用于实验。重组人表皮生长因子(EGF)购自Pep Rotech公司 (United States)，溶于无菌去离子水，加入RPMI1640培养基稀释成所需浓度用于实验。RPMI1640、胎牛血清(Hyclone公司)，anti-EGFR单克隆抗体(Monoclonal Antibody，MAb),anti-ERαMAb、phospho-EGFR Y1068 MAb(Cell Signaling Technology)，anti-ERβ多克隆抗体(Polyclonal Antibody，PAb)(PanVera)，其余实验试剂为国产分析纯试剂。HERA cell 细胞培养箱(德国Heraers公司)，低温高速离心机(德国Heraers公司)，酶标仪(美国Clinibio公司)，Gel Doc 1000凝胶成像系统(Bio-Rad公司)，紫外分光光度计(NanoDrop公司)，PCR仪(Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1MTT法检测吉非替尼、氟维司群单药及联合用药作用后肺癌细胞的存活率 采用MTT法观察氟维司群和吉非替尼单药和联合用药对肺癌细胞增殖的影响。实验时，取对数生长期细胞，制备单细胞悬液，以4×104/mL的浓度，接种于96孔细胞培养板中，每孔200 μL(边缘孔用无菌PBS填充)，在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育24 h贴壁后，加入浓度梯度的吉非替尼、氟维司群、吉非替尼+氟维司群,每组浓度设5个复孔，在37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养48 h(浓度梯度的确定方法为：结合文献，先采用10个浓度梯度，根据所得结果，采用细胞存活率分布于20%～80%之间的药物浓度，再定5个浓度梯度)。实验结束后每个孔内加入20 μL的MTT(5 mg/mL)，37 ℃培养4 h后，终止培养，弃上清，每孔加入150 μL的DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使蓝色结晶充分溶解。用自动酶标仪测定490 nm波长处每孔的吸光度A，计算各实验组肿瘤细胞的存活率。细胞存活率(%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%。其中As：试验孔(含有细胞的培养基、MTT、吉非替尼/氟维司群)，Ac：对照孔(含有细胞的培养基、MTT)，Ab：空白孔(不含细胞的培养基、MTT)。运用SPSS10.0软件根据药物浓度与细胞存活率求出不同时间的半数抑制浓度(IC50)。

1.2.2Western blot检测ER、EGFR在肺癌细胞株中的表达情况以及吉非替尼、氟维司群对EGFR信号通路的调控 取实验用细胞，以冰PBS洗涤3遍，加入RIPA细胞裂解液，镜下观察细胞充分裂解后，收集细胞总蛋白。经过SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，将膜置入5%脱脂牛奶中封闭，4 ℃过夜。次日，将膜置于37 ℃复温 30 min后，加入一抗(一抗以5%脱脂牛奶TBST液稀释，一抗稀释浓度1∶1000，β-actin为1∶500)，与膜反应，37 ℃ 2 h，TBST漂洗3遍后，加入二抗(二抗以5%脱脂牛奶TBST液稀释，均为1∶3000)，37 ℃ 30 min。化学发光显影成像。所有实验均重复3次。EGFR介导的信号通路的开启是需要通过EGFR的快速活化来实现的，其重要标志是EGFR磷酸化急剧上升。

a:吉非替尼；b：氟维司群图2 MTT法检测不同浓度的吉非替尼或氟维司群对H1975、H1650及PC-9的抗增殖效应

2 结 果

2.1H1975、H1650及PC-9肺癌细胞中ER和EGFR的表达情况 WB结果显示EGFR和ER在3株肺癌细胞株中均有表达，EGFR的表达量PC-9细胞要明显高于H1975细胞，在H1650细胞中仅微弱表达。ERα在H1650细胞及PC-9细胞中表达量近似，均略高于H1975，而ERβH1650细胞及H1975中表达量相近，在PC-9细胞中表达量较少。见图1。

图1 EGFR、ERα、ERβ在H1975、H1650及PC-9肺癌细胞株的基础表达量

2.2吉非替尼和氟维司群单药对H1975、H1650及PC-9细胞增殖的影响 不同浓度吉非替尼/氟维司群作用下，H1975、H1650及PC-9细胞的细胞存活率见图2。随着药物浓度增加，细胞存活率减少。实验中所用H1975、H1650及PC-9肺癌细胞株的EGFR均含有不同位点的突变，在单药实验中也体现出了这些突变对吉非替尼敏感性的影响：H1975及H1650因分别含有二次突变T790m及PTEN Del表现出耐药(IC50gt;10 μmol/L)，PC-9细胞株仅含有位于exon19的一次突变而表现出对药物的敏感(IC50≈0.03 μmol/L)。

2.3吉非替尼和氟维司群联合用药对比单药对H1975、H1650及PC-9细胞抗增殖的影响 采用MTT比色法检测的结果显示，1 μmol/L的吉非替尼和3 μmol/L的氟维司群联合或单药处理细胞48 h后，PC-9细胞的增殖率明显低于单独使用吉非替尼或氟维司群的实验组(Plt;0.001)，处理H1650细胞得到的结果一致(Plt;0.001)，而这种差异在含有EGFR T790m突变的H1975细胞株中体现得更加突出(Plt;0.0001)。见图3。

图3 MTT法检测吉非替尼与氟维司群联合与单一用药对H1975、H1650及PC-9细胞的抗增殖作用的比较

2.4雌激素及其拮抗剂对T790m突变型EGFR信号通路的调控 以10 nmol/L 17β-雌二醇处理H1975细胞10 min发现EGFR磷酸化水平明显增高，以1 μmol/L的吉非替尼和3 μmol/L的氟维司群分别处理H1975细胞10 min可以下调EGFR的磷酸化水平，当叠加这2种处理时这种变化更加显著。表明EGFR及雌激素信号通路间存在交叉现象。见图4。

图4 吉非替尼与氟维司群联合与单一用药以及雌激素对H1975细胞株中EGFR磷酸化水平的影响

2.5在EGFR-TKI获得性耐药的肺癌细胞株中雌激素、EGF分别下调EGFR、ER的水平，氟维司群、吉非替尼分别上调EGFR、ER的水平 以10 nmol/L 17β-E2的处理H1975细胞7 d发现细胞内EGFR的蛋白量与对照组相比均明显减少，加入3 μmol/L氟维司群处理的细胞EGFR则呈现相反的表达趋势。表明雌激素除了可以激活EGFR信号通路，也能抑制EGFR的表达。H1975细胞分别给予10 ng/mL表皮生长因子(EGF)，1 μmol/L 吉非替尼培养7 d，检测发现与未经处理的细胞相比，EGF下调ERs的表达，而吉非替尼则上调ER的表达。见图5。

图5 吉非替尼、氟维司群、雌激素、表皮生长因子长时间作用后(7 d)对H1975细胞EGFR及ER表达量的影响

3 讨 论

近年来有越来越多的证据表明，类固醇激素(包括雌激素)在肺癌的发生发展中起到了重要的作用[20-21]。雌激素可以刺激NSCLC细胞的增殖，并且可以促使细胞中的EGFR发生快速磷酸化，从而激活其下游信号通路[22]。此外，一些研究也表明雌激素受体(estrogen receptor, ERαamp;β)，尤其是ERβ在肺肿瘤的发生和存活中扮演着重要的角色[23-24]。无论从男性还是女性患者肺癌组织中分离所得的肺癌细胞株均可检测出ERs，并受到雌激素的调控[25]。ER一方面可通过形成雌激素-受体复合物，与细胞核内染色质的特定部位结合，刺激mRNA转录，产生多种影响细胞生长及代谢的蛋白质[22]；另一方面，通过蛋白与蛋白间的作用与其他转录因子信号通路产生交叉，对细胞的增殖和分化产生重要调控。比如生长因子EGF可以替代雌激素，通过ERK通路激活ER的促转录活性[26]；另外，最近有研究也表明存在非核的ER可以激活PI3K和EGFR家族受体[27]。这些研究揭示在ER和EGFR共表达的肿瘤细胞中，ER和EGFR均可能通过这些相互交叉的信号通路促进细胞增殖，同时增强雌激素和表皮生长因子的生物学效应。因此有科学家猜想结合EGFR-TKI与抗雌激素同时靶向两个信号通路对于治疗肺癌可能是可行的方案，2013年Garon等[20]就曾在一个Ⅱ期临床试验中应用厄洛替尼联合氟维司群治疗晚期NSCLC患者，并获得了一定的疗效。

考虑到雌激素及ER在肺癌发生发展中的作用，以及EGFR-TKI的使用优势人群和获得性耐药现象，我们推测EGFR-EKI可能持续上调了肿瘤细胞内ER的表达，通过ER介导的其他途径补偿了被抑制的EGFR介导的信号通路，从而表现出耐药。因此，我们猜想联合EGFR-TKI和抗雌激素治疗能有利于阻断EGFR-TKI耐药肺癌细胞株中交叉的生长途径间的信号传导，有助于推迟吉非替尼耐药性的出现。为此，我们选取了3株NSCLC细胞株：H1975(T790m 耐药)、H1650(PTEN 耐药)和PC-9(Del E746-A750 敏感)，联合或单独使用EGFR-TKI吉非替尼与雌激素受体拮抗剂氟维司群分别处理3株细胞，在细胞水平上比较两药联合对肿瘤细胞增殖的抑制效果，希望为两药联合治疗对EGFR-TKI获得性耐药的NSCLC提供一些理论上的依据。我们首先从分子学水平检测了3株NSCLC细胞株中EGFR及ER的表达，Western Blot显示H1975、H1650和PC-9细胞中均有EGFR和ER表达，但两种蛋白在不同细胞株中的表达量有所差异。随后的细胞增殖的检测结果证明，两药联合与单独一种药物处理比，3株细胞的增殖率明显降低。以上这些实验结果从细胞水平上表明：吉非替尼联合氟维司群可放大对ER阳性T790m突变型EGFR的NSCLC的抗增殖效应。

为了从分子水平上研究ER与T790m突变型EGFR信号通路的交叉关联，我们用表皮生长因子(EGF)和雌激素分别处理H1975细胞，观察到处理后的H1975细胞中ER和EGFR的表达量下调，以吉非替尼和氟维司群分别处理后，上述受体的表达量则明显上调，这提示我们耐药细胞株内ER和T790m突变型EGFR交叉的信号通路存在不同的时间效应：一方面，雌激素可通过与ER结合快速激活T790m突变型EGFR下游的信号通路；另一方面，两者在较长时间相互作用后，可通过互逆的表达调控相互影响。这揭示了吉非替尼联合氟维司群逆转EGFR-TKI耐药肺癌细胞增殖的分子机制：氟维司群阻断吉非替尼上调ER表达量进而导致的ER信号通路的增强，抑制ER介导的EGFR信号通路的激活。这样一种两个通路之间相互调控的机制为尝试联合两种药物进行治疗提供了有力的理论依据。

总之，我们的研究初步证明了针对ER和EGFR的信号交叉，采用EGFR的靶向治疗与抗雌激素治疗相结合的治疗方案提高EGFR和ER阳性的EGFR-TKI获得性耐药的NSCLC的治疗效果在理论上是可行的。

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2017-05-15;

2017-07-14)

(本文编辑：叶华珍; 英文编辑：王建东)

Theantitumoreffectofanti-estrogentherapyonnon-smallcelllungcancercelllineswithacquiredresistancetoEGFR-TKI

XU Rui-tong1,SUN Kang-jun2,DAI Guan-qun1,XU Jing3

(1.DepartmentofGeneralPractice，JiangsuProvinceHospital，Nanjing210029，Jiangsu，China;2.SchoolofPublicHealth，NanjingMedicalUniversity，Nanjing211166,Jiangsu，China;3.DepartmentofOncology，JiangsuProvinceHospital，Nanjing210029,Jiangsu，China)

ObjectiveTo investigate the antitumor effects of combination of gefitinib and fulvestrant on NSCLC cell lines with acquired resistance to gefitinib.MethodsThe antitumor effect of gefitinib and fulvestrant on the growth of NSCLC cell lines was observed at different concentrations by MTT assay. The expression levels of EGFR, ER and p-EGFR were determined by Western blot.Results① All three lung cancer cell lines expressed both EGFR and ERs although to different extents. ② Compared with treatment of either fulvestrant or gefitinib alone, drug combination obviously decreased proliferation of H1976,H1650 and PC-9 cells lines (Plt;0.001). ③ Rapid activations of EGFR pathway by estrogen were observed in H1975 cells with T790M mutation. ④ EGFR and ERs expression were down-regulated respectively in response to estrogen and EGF but up-regulated in response to fulvestrant and gefitinib in vitro.ConclusionThese results suggest that there is a functional crosssignaling between the EGFR/ER pathways in NSCLC with acquired resistance to gefitinib, possibly providing rationale for combining gefitinib with anti-estrogen therapy for advanced NSCLC treatment.

Gefitinib；Fulvestrant；Non-small cell lung cancer；Epidermal growth factor receptor；Acquired resistance

R365；R735.37

A

1672-271X(2017)06-0581-06

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.06.006

江苏省六大人才高峰资助项目(2015-WSW-022)

1. 210029南京，江苏省人民医院全科医学科；2.211166南京，南京医科大学公共卫生学院；3. 210029南京，江苏省人民医院肿瘤科

徐 静，E-mail：517068680@qq.com

徐瑞彤，孙康俊，戴冠群,等.抗雌激素治疗对耐酪氨酸激酶抑制剂非小细胞肺癌细胞株抗增殖作用的机制探讨[J].东南国防医药，2017,19(6):581-586.