分辨率革命——冷冻电子显微学在结构生物学研究中的进展

陈振国 徐彦辉

(1复旦大学生物医学研究院 上海 200032; 2复旦大学附属上海市第五人民医院 上海 200240;3复旦大学附属肿瘤医院 上海 200032)

专家简介徐彦辉,复旦大学附属肿瘤医院研究员,复旦大学生物医学研究院兼职教授、博士生导师,国家杰出青年基金获得者,教育部长江学者特聘教授。中国生物物理学会理事,科技部“重点研发计划”项目负责人。

长期从事表观遗传调控的结构与功能研究,系统地阐明了DNA甲基化和组蛋白甲基化修饰关键酶的催化、底物识别和酶活性调节的分子机制。在DNA甲基化和去甲基化调控的分子机制及结构研究方面取得了一系列国际前沿的成果,不仅对表观遗传调控机制的深入理解有重要贡献,也为靶向表观遗传调控蛋白的药物设计提供了重要的结构基础。发表通讯作者论文20余篇。其中包括Nature(2篇)、Cell(1篇)、MolecularCell(2篇)、NatureCommunications(2篇)、Genesamp;Development(2篇)、CellResearch(7篇)等。研究成果得到国内外同行的高度评价(在Faculty1000、Cell、NatureChina、ScienceSignaling等专门评述),曾多次受邀在重要国际会议上作大会报告。

曾荣获2016年教育部自然科学一等奖(第一完成人)、首届中国优秀青年科技奖、谈家桢生命科学奖、树兰医学青年奖、中源协和生命医学奖、药明康德生命化学奖、贝时璋青年生物物理学家奖、明治生命科学奖(杰出奖)、第7届上海青年科技英才等多个奖项。

专家简介陈振国,博士毕业于荷兰格罗宁根大学应用物理系,后师从著名结构生物学教授Michael Rossmann,从事冷冻电子显微镜在结构生物学研究中的应用。现为复旦大学附属上海市第五人民医院青年研究员,复旦大学生物医学研究院兼职青年研究员,从事结构生物学的冷冻电镜方向研究,解析与疾病相关生物大分子的原子结构,揭示相应大分子的致病机制,为疫苗研发、小分子抑制剂设计、以及治疗性药物开发提供理论基础。

上海医学院创建90周年寄语值此上医90年庆之际,衷心祝愿上医更上一层楼,我们年轻人要向前辈学习,为生命医学的发展贡献微薄之力。

分辨率革命
——冷冻电子显微学在结构生物学研究中的进展

陈振国1,2徐彦辉1,3△

(1复旦大学生物医学研究院 上海 200032;2复旦大学附属上海市第五人民医院 上海 200240;3复旦大学附属肿瘤医院 上海 200032)

冷冻电子显微学具有悠久的历史,近年来随着硬件设备的革命性技术突破和软件算法方面技术发展,已经成为结构生物学领域最为重要的研究方法,也代表了未来的发展方向。其中,单颗粒三维结构重构法在最近的几年发展迅速,极大地拓展了研究方法的适用范围,并不断刷新所解析结构的高分辨率记录,成为结构生物学及相关学科最为激动人心的研究领域。本文将针对冷冻电子显微学发展的历史,近期革命性技术突破,以及复旦大学在该领域的布局和进展做简要介绍。

冷冻电子显微学; 结构生物学; 单颗粒重构

结构生物学是分子生物学、生物化学和生物物理学的分支,研究生物大分子尤其是核酸,蛋白质及其复合物的分子结构,通过解析生物大分子的原子分辨率或近原子分辨率三维结构,指导基于结构的功能分析,揭示生物大分子结构与功能的关系,阐明分子机器的工作机制,为靶向药物提供结构基础[1-3]。核磁共振波谱学、X射线晶体学和冷冻电子显微学是结构生物学的三大主要分支。

自1957年核糖核酸酶的结构解析以来,核磁共振波谱法已成为一种成熟的结构生物学方法[4-5]。但是,该方法所分析生物大分子样品的分子量一般不超过50 kD。同样是在1957年,John Kendrew 运用X射线晶体方法解析了第一个生物大分子晶体结构——抹香鲸肌红蛋白结构,分辨率达到了6 Å[6]。并经过3年努力将分辨率提高到了2 Å[7]。同时发展出来的同晶置换法[8]和分子置换法[9],成功解决了晶体学的相位问题。随着后续一系列技术突破和硬件设备提升,尤其是同步辐射光源大范围建设和射线强度的提升,使得X射线晶体学逐步发展成为结构生物学的最为主要的研究手段。从20世纪90年代初至今,X射线晶体学在结构解析数量和质量方面都遥遥领先于其他结构生物学方法。利用该方法获得的生物大分子结构,从分子层面上提高了我们对于生命过程的认识,并大大促进了现代医学的发展[10]。X射线晶体学最大的局限就是要获得可衍射的晶体,而生物大分子结晶本身就是一个非常耗时和具有挑战性的工作,尤其是对膜蛋白和超大分子量的复合物,其结晶异常困难,极大地阻碍了对这些重要生命分子结构的解析和功能的理解[11]。冷冻电子显微学在近年来有了关键的技术突破,很好的解决了上述限制,使得曾经非常难以获得的结构解析难度大大降低,与核磁共振波谱学和X射线晶体学形成了完美的互补,并带来了结构生物学前所未有的蓬勃发展。

2017年10月4日,瑞典皇家科学院宣布将2017年度诺贝尔化学奖授予瑞士洛桑大学科学家Jacques Dubochet、美国哥伦比亚大学科学家Joachim Frank 和英国医学研究委员会科学家Richard Henderson,以表彰他们在开发冷冻电子显微学、用于确定溶液中生物分子的高分辨率结构方面所作出的贡献。该学科的发展同时简化并改进了生物分子的成像,将生物化学推进到一个新的时代。冷冻电子显微学用于结构生物学研究有3个基本方法:电子晶体学、单颗粒三维重构法和电子断层扫描成像技术。其中,单颗粒三维重构法可以将几十万甚至几百万个大分子颗粒的图像,根据方向性进行分类和平均以提高图像信噪比,更容易得到大分子的原子分辨率三维结构,使得该方法成为结构生物学研究中至关重要且不可替代的研究手段[12-13]。

冷冻电子显微学与结构生物学冷冻电子显微学以深冷温度下(-150 ℃以下,通常是液氮温度即-196 ℃)的生物大分子样品为研究对象,整个流程包括冷冻样品制备、电子显微镜图像收集、图像数据处理进行生物大分子三维结构重构以及三维结构的解析等几个基本步骤。区别于传统电子显微学镜生物样品的染色或者固定处理方法,样品的快速冷冻处理在最大程度上保持其原始状态。1974年,R.Glaeser 和 K.Taylor 使用液氮快速冷冻蛋白质晶体样品[14],大大减少了生物样品在观察过程中的电子辐射损伤;1984年,J.Dubochet等将该液氮快速冷冻技术实用化,得到了非晶冰层中冷冻的病毒颗粒[15]。之后,该方法成为冷冻电镜通用样品制备方法。与之相反的是,X射线晶体学样品的制备要求将大分子样品进行结晶,把样品置于非生理的环境中,这就可能偶然引起样品与功能无关的构象变化。因此,冷冻电镜子问世以来就具有其独特的优势。

电子晶体学 电子晶体学使用电子显微镜收集生物大分子晶体的衬度图像或者衍射图样,用于解析这些生物大分子的三维结构。由于电子波长(100 kV和300 kV加速电压时分别为3.70 pm和1.96 pm)比X射线波长要小很多(位于美国芝加哥阿贡国家实验室的先进光子源常用波长为0.5 Å或更大,而小角X射线散射所用波长可以达到0.035～0.3 Å,1 Å=100 pm),因此电子晶体学作为X射线晶体学的一个补充方法出现,可以研究很小的晶体(lt;0.1 μm)。通常,这些小尺寸的晶体是没法通过X射线晶体学进行研究的。虽然早在1975年,中等分辨率膜蛋白结构已经通过电子晶体学方法解析,但是,第一个原子分辨率结构直到1990年才由Richard Henderson获得[16]。

单颗粒三维重构法 1968年,A.Klug和D.De Rosier发现中心截面定理——实空间三维物体沿某角度的二维投影,其傅里叶变换等价于该三维物体的傅里叶变换中与投影方向垂直的中心截面。据此,他们提出了单颗粒三维重构的思想,并应用于重构噬菌体T4的尾部结构[17]。简单地讲,单颗粒法三维重构法通过收集大分子样品在成像设备上的衬度图像,通常包括几十万甚至上百万单个大分子颗粒,将相同或相近方向性的颗粒进行平均,得到信噪比较高的二维图像,如果这些二维图像的分布足够弥散,代表着单个颗粒不同角度的二维投影,应用中心截面定理,将他们的傅里叶变换插入到三维傅立叶空间中,然后进行反傅里叶变换,就可以得到实空间的三维物体。

冷冻电子显微学单颗粒三维重构法(此后简称单颗粒法),自问世以来因其对样品纯度和数量更为宽松的要求,在生物大分子三维结构解析中,因无需结晶且所得结构更接近原始状态,使其成为最具有发展前途的技术手段[13]。在过去几十年中,整个领域见证了单颗粒法所解析结构分辨率的持续改进,从上世纪末的亚纳米分辨率,到2008年的近原子分辨率,以及2010年的原子分辨率[13,18]。

2013年12月份,程亦凡和D.Julius 合作发表在Nature上的2篇文章,在结构生物学领域造成了巨大的反响。他们首次运用单颗粒法获得了膜蛋白TRPV1的3.4 Å分辨率结构,并成功搭建了该大分子的原子模型,标志着冷冻电镜单颗粒法进入了一个新的时代[19-20]。一项革命性的技术运用到了他们的工作中,即基于互补金属氧化物半导体(complementary metal oxide semiconductor,CMOS)的直接电子探测器(direct electron detection device,DDD)。在DDD出现之前的图像收集通过感光底片或者电荷耦合元件(charge-coupled device,CCD)相机来完成,两种方法都有其致命缺点。使用感光底片时,为了积累足够的信息,一张底片的曝光时间约为1 s。因此,电子照射引起的样品漂移就会积累在图像中,引起图像细节的模糊。同时,底片的检测量子效率(detective quantum efficiency,DQE)也低于DDD的DQE。使用CCD时,虽然可以通过多次短时曝光消除过大漂移引起的图像模糊,但是由于CCD特有的成像原理,经过了电子-光子-电子的二次转换,使得CCD在中高分辨率范围的DQE大大低于DDD[21]。因此,底片和CCD收集的图像数据在高分辨率范围的数据质量都低于DDD图像数据。

直接电子探测器硬件技术的进步推动了软件算法的革新。电子辐射引起的样品漂移可以通过MotionCorr[22]和Unblur[23]软件进行校正,使得长时间低剂量曝光成为可能,这正是被普遍认为的提高DQE的关键[24-26]。基于高性能计算机集群、以及后来出现的基于图形处理器(graphics processing unit,GPU)加速工作站的数据处理软件Relion[27]和Frealign[28],在大大减少计算机时的同时,也体现了数据处理的可视化和用户友好化的发展趋势。

随着硬件和软件的相互促进,单颗粒法大大拓宽了结构生物学的研究对象,尤其是之前难以获得晶体的膜蛋白和大分子量的蛋白复合物[29-30]。同时,单颗粒法所解析结构的分辨率也在不停被刷新。2015年,20S蛋白酶体的冷冻电镜结构达到了2.8 Å的高分辨率[31]。同一年,β-半乳糖苷结构的分辨率达到了2.2 Å[32]。2016年,冷冻电镜单颗粒法所能解析结构的极限分辨率更是被推进到了1.8 Å的较高原子分辨率水平[33]。一般来讲,大分子的分子量越小,越难以解析高分辨结构,比如1.8 Å 分辨率的谷氨酸脱氢酶的分子量为334 kD,而分子量为145 kD的乳酸脱氢酶和 93 kD的异柠檬酸脱氢酶通过同样的方法,解析所得结构的分辨率分别只有2.8 Å 和3.8 Å[33]。在提高冷冻电镜数据图像信噪比、提高单颗粒法三位重构结构分辨率方面,尤其是解析较小分子量样品时,与传统基于欠焦的方法相比,相位板技术展现出了不可比拟的优势,已经成功解析分子量只有64 kDa的人类血红蛋白的3.2 Å 原子分辨率结构[34]。所有这些进步使得冷冻电镜单颗粒法成为高分辨率生物大分子结构解析中,可以与X射线晶体学相媲美的快速、经济的测定方法。

电子断层扫描成像技术 1970年,在单颗粒法提出两年之后,同样是A.Klug和D.De Rosier 发展了电子断层扫描成像技术[35]。该方法通过在电子显微镜内将样品倾转至不同角度,获取同一区域多个角度的投影图来重构所研究对象的三维结构[36]。电子断层成像使用尺度非常广泛,从分子水平的蛋白质大分子,到亚细胞水平的细胞器,甚至细胞水平的组织结构等。虽然,在目前技术水平下,该方法还不能获得核磁共振波谱法、X射线晶体学和冷冻电镜单颗粒法等所能获得的高分辨率结构,但是它有效填补了以上高分辨率结构与光学显微镜地分辨率结构之间的中等分辨率水平细胞整体图像的空白。

冷冻电子显微学的独特优势

自然生理状态 冷冻电镜快速冷冻技术,将悬浮在水溶液中的样品,快速冷冻至深冷温度。由此,保存在玻璃态冰层中的生物样品保留了生物样品在溶液中的状态,更接近其在细胞中的自然生理状态[15]。

样品需求量少 冷冻电镜样品需求量非常少。比如单颗粒法,制备1个冷冻样品只需体积3 μL浓度为1～10 μg/μL的溶液。如果生物大分子的结构均一性比较好,一般只需几万至几十万单个颗粒,就可以通过单颗粒法重构其高分辨结构[19-20]。而对于具有二十面体结构(12个等价顶点,每个顶点具有5重旋转对称性,总60重对称性)的病毒颗粒,只需几千个颗粒就可重构其原子分辨率结构[37]。这与核磁波谱法和X射线晶体法需要大量样品形成了鲜明对比。

样品均一性要求比较低 与核磁波谱法和X射线晶体法分析所得样品统计平均信息不同,冷冻电镜法通过电子显微镜将生物大分子通常放大几万至几十万倍,并收集其单个颗粒的数字化图像。因此,数据处理软件可以将单个颗粒与其他颗粒进行比对,根据相似性,一定程度上(受限于分辨率)区分出不同组成甚至不同构象的颗粒类型,分别重构出相应组成或构象颗粒的高分辨结构。从而,对样品的均一性要求比核磁波谱法和X射线晶体法的要求要低。并且,由于单颗粒可能同时重构大分子在同一批次样品中的不同组成或构象,有助于我们理解大分子的热力学及动力学信息[38]。

研究对象广泛 核磁波谱法所分析的生物大分子的分子量一般不超过50 kD,而获得大分子晶体是X射线晶体学一直面临的最大挑战和限制[11],使得这两种结构生物学方法具有不可避免的限制性。而冷冻电镜方法可以研究的对象十分广泛,从分子水平的蛋白质大分子,到亚细胞水平的细胞器,甚至细胞水平的组织结构等。其中,单颗粒法所能解析高分辨大分子的分子量,不断在突破上限和下限。目前,分子量下限为64 kD的人类血红蛋白的3.2 Å 原子分辨率结构[34],以及上限约为50 000 kD的T4噬菌体的3.3 Å 原子分辨率结构已经被成功解析[39]。

冷冻电子显微学的挑战和前景由于DDD元件的应用,冷冻电镜法在过去5年内所解析的高分辨结构数量远远超过了自诞生以来至DDD技术之前50年的总和。但是,随着冷冻电镜学研究的深入,对该学科各项技术提出了更高的要求。一些技术难点逐渐凸显,成为制约其发展的瓶颈。

冷冻样品制备 高纯度生物大分子样品提纯分离之后,冷冻样品的制备一直是冷冻电镜学中至关重要的一步,尤其是对分辨率结果要求比较高的单颗粒法。冷冻制样技术[15]自从30年前发明以来没有实质性的革新,实验条件的通用性和重现性都较差。首先,样品溶液与负载碳膜的相互作用受溶液的缓冲液种类、活性剂或添加剂、大分子性质和浓度等因素的制约,决定了是否能够制备冰层厚度适中、厚薄均一的冷冻样品。其次,大分子在冰层中的分布是否均匀无聚集,是否有利于分布在冰层孔洞中而不是较厚承载碳膜上,统计上来讲所有颗粒是否有择优取向等,对数据质量的影响举足轻重[40]。在替代性冷冻样品制备方法研究方面,Carragher博士及同事一直走在同行的前面[41],并积极研发极微量皮升量级(目前通用3 μL的百万分之一)喷墨式制样技术。而冷冻聚焦粒子束技术使得观察生理状态细胞内局部区域的高分辨结构成为可能[42]。

电子光学成像技术 亚埃尺度的材料科学超高分辨率研究在过去十几年取得了长足的进步,配备了色差矫正和球差矫正的透射电镜可以达到0.5 Å的水平[43]。而在冷冻电镜进行生物样品的结构解析中,使用了球差校正技术所收集数据只是突破了3 Å[44]。因为冷冻样品冰层厚度的限制,使得色差矫正或球差矫正并不能发挥其应有的作用。但是,在增强信噪比方面,Volta相位板的使用在提高分辨率水平方面具有明显促进的作用[34,45-46]。该技术的升级或者新型相位板的开发和使用,会进一步提高信噪比提高分辨率水平。

体内环境细胞结构研究 不管是核磁波谱法,X射线晶体法,还是冷冻电镜单颗粒法,这几种结构生物学的研究方法都通用分离纯化体外环境的生物大分子的方法,解析其三维结构,来理解大分子在生物学过程中的重要作用。冷冻电镜中的电子断层扫描成像技术是唯一可以让我们直接观察细胞内或体内大分子的结构。但是,其分辨率受限于10 Å左右[46],无法达到原子分辨率。主要原因是,电子断层扫描的样品选用同一区域来收集约100张不同倾转角度的图像,为了防止任何一张倾转图过度曝光,每一张图像的信号强度都比较小。这就限制了图像的信噪比。同时,即使选择很小的角度增量,同一区域所能收集的倾转图像还是有限的。因此无法通过叠加大批量的数据来增强信噪比。这两个原因都决定了相位板等图像信噪比增强技术的任何进步,都会大大推动电子断层扫描成像技术的分辨率水平。

复旦大学冷冻电镜平台建设规划及进展复旦大学生物医学研究院于2013年底向复旦大学提议,建设高分辨冷冻电镜平台。经过认真调研和专家论证等过程,复旦大学于2015年底正式批复,投入近7 000万人民币建设完备的冷冻电镜平台,积极引进相关人才。2016年底完成设备招标与合同签订,2017年底所有设备到货。整个过程中得到了复旦大学各级校领导和职能部门的高度重视和大力支持。

我校拟建设的高分辨冷冻电镜平台主要包括3台冷冻电镜及附属设备和高性能计算机集群。其中电镜包括1台300 kV的Titan Krios透射电镜,配备K2直接电子探测相机和能量过滤器,主要用于高分辨数据的采集;1台200 kV的Talos Arctica透射电镜,配备K2直接电子探测相机,主要用于冷冻电镜样品的筛选和部分数据采集;1台120 kV的Talos 120电镜,主要用于样品的初步筛选和制样条件优化。这3台设备互为补充,能够使高端产品(300 kV电镜)充分发挥功效而不浪费机时,这是目前国内外搭建冷冻电镜平台普遍采用的方案。高性能计算机集群投入450万人民币,搭建高速读写优化的整体框架,包括1 000个核的CPU计算系统和6个GPU节点(每个节点含4块Tesla P100显卡)及200 T的存储服务器,用于存储处理电镜系统所产生的大量数据和后续的结构解析。

该平台为复旦大学公共技术平台的组成部分,委托生物医学研究院(Institutes of Biomedical Sciences)代为筹建管理。拟放置于正在建设的复旦大学医学院科研2号楼地下3层,占地面积约500平方米。该设备对震动、电磁信号干扰、温度变化等因素都非常敏感,因此对设备所在的环境提出了非常高的要求。为了使设备能够以最佳状态运作,复旦大学医学院工程建设指挥部、工程建设承担单位、生物医学研究院、冷冻电镜相关设备供应商(FEI公司和Gatan公司等)指定专门人员,根据设备要求对2号楼相关空间进行了充分的论证,从而确定了最优方案。目前低端120 kV的电镜和高性能计算机集群系统已经在生物医学研究院安装完成,处于试运行阶段。待科研2号楼工程竣工,即可开展房间装修和设备安装调试,预计于2018年底投入试运行。

该平台面向复旦大学所有用户,并保证部分机时以满足对外服务。运行维护团队将包括由2～3位精通冷冻电镜系统的专家组成的指导小组,2位高级工程师和2位中高级工程师。拟提供24 h服务,全年除重要节假日和仪器维护时间外均对外开放。

总结冷冻电子显微学研究开始于1974年,经过了几十年的发展,于本世纪初第一次实现了原子分辨率结构的成功解析。2013年的革命性技术突破以及过去几年的快速发展,奠定了冷冻电镜尤其是单颗粒法在结构生物学中不可或缺的地位。随着冷冻电镜研究的深入开展,一些技术难点逐渐凸显。世界各地的研究组围绕这些问题开展的创新性研究,已经在冷冻样品制备、电子光学成像和体内环境细胞结构研究等方面展现出了良好的发展前景。

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Resolutionrevolution:advancesandprospectsofcryo-EMinstructuralbiology

CHEN Zhen-guo1,2, XU Yan-hui1,3△

(1InstitutesofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2ShanghaiFifthPeople’sHospital,FudanUniversity,Shanghai200240,China;3ShanghaiCancerCenter,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Cryo electron microscopy (cryo-EM) is one of the most important methods in structural biology.In the past five years,cryo-EM has milestone breakthrough due to revolutionary advances in hardware and methodology.The resolution has been pushed to as high as 1.8 Å,which significantly extended the research scope of this method.Single particle reconstruction method has become one of the most exciting fields of structural biology and related subjects.Here we will briefly introduce the history of cryo-EM,recent revolutionary breakthrough,and the facility at Fudan University.

cryo electron microscopy; structural biology; single particle reconstruction

Q617

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.06.017

国家重点研发计划(2016YFA0500700)

△Corresponding author E-mail:xuyh@fudan.edu.cn

*ThisworkwassupportedbytheMinistryofScienceandTechnologyofChina(2016YFA0500700).

2017-10-08;编辑:张秀峰)