乙肝表面抗原与慢性乙肝的功能性治愈

闻玉梅 汪萱怡

(复旦大学上海医学院教育部/卫计委医学分子病毒学重点实验室 上海 200032)

专家简介闻玉梅,女,1934年出生,教授,博士生导师。1999年当选中国工程院院士。1986年至2002年任卫生部医学分子病毒学重点实验室主任,现任教育部/卫计委医学分子病毒学重点实验室学术委员会委员。主要研究领域为医学微生物学、肝炎病毒分子生物学及免疫学。长期从事医学微生物学教学与研究,特别是在研究乙肝病毒的分子生物学与免疫学领域中作出了系统的、有创新性的贡献。所研究的乙肝治疗性疫苗已进入Ⅲ期临床研究,被认为是研制治疗性乙肝疫苗的开拓者之一。

在科研、教学及培养人才的事业中成绩卓越。曾获国家发明专利两项(其中一项为国际专利)。曾获国家自然科学奖、国家科技进步奖及部与省、市级科技进步奖等共9项。主编多部中英文专著,其中1992年出版的英文专著《中国病毒性肝炎:问题与对策》一书由瑞士Karger出版社出版与发行,备受关注。注重医学人文教育,培育医德高尚的医学人才。2014年在复旦大学开设《人文医学导论》研究生课程,2015年该课程面向全国大学生实现网络共享;在此基础上,2017年由复旦大学出版社出版著作《医学与人文交响曲》,以学科交叉和整合的方式引导医学生建立医学伦理和哲学思维。

上海医学院创建90周年寄语珍惜传统,发扬传统,创新传统

乙肝表面抗原与慢性乙肝的功能性治愈

闻玉梅△汪萱怡

(复旦大学上海医学院教育部/卫计委医学分子病毒学重点实验室 上海 200032)

治愈乙肝(功能性治愈乙肝)已成为国内外有关学者研究的重要目标。功能性治愈乙肝的指标为:持久的HBsAg消失(伴有或不伴有血清抗HBs阳性),血清HBV DNA阴性,cccDNA处于非活动转录状态,停止治疗后疾病没有复发。本文在简述HBsAg的已知与未知的基础上,阐述了免疫治疗乙肝的现状,重点介绍了本室研发HBsAg-HBIG治疗性疫苗的实验与临床研究。根据核苷类抗病毒药物可清除HBV DNA,中和性HBsAg抗体的被动免疫作用,已证实HBsAg-HBIG有较强的主动免疫作用,提出了清除HBsAg的“三明治”方案:第一层用抗病毒药物,第二层被动免疫用抗HBs抗体,当血清HBsAg未能测及后,第三层注射HBsAg-HBIG复合物作主动免疫,目标为诱生患者对HBsAg产生持久的免疫,从而使cccDNA处于非活动状态,可能会达到功能性治愈。

慢性乙肝; 乙肝表面抗原; 治疗性疫苗; 治愈

通过有效地推行预防乙肝的计划免疫,我国人群的乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)携带率从20世纪80年代的10%左右,至2006年公布的统计数据已降至7.16%,其中5岁以下的儿童慢性乙肝感染率已降到1%以下,达到世界卫生组织提出的低于1%的水平[1]。但是,目前我国仍有约7 800万的乙肝感染者,其中慢性乙肝患者约2 000万。每年有30万患者因肝癌而死亡,占全球的51%,其中大多数与乙肝病毒( hepatitis B virus,HBV)感染相关[2]。自20世纪80年代开始用干扰素治疗,以及90年代后期根据针对HIV逆转录酶研发的诸多药物移用到治疗乙肝以来,一批药物已成功地用于临床,并证实可以抑制乙肝病毒复制。但是,干扰素的不良反应,以及抗病毒药物导致的病毒耐药变异及停药后的病毒反跳等,仍是乙肝治疗中存在的问题。

近年来,治愈乙肝(功能性治愈乙肝)已成为国内外学者们研究的主要目标。目前对完全治愈的定义是:全部被感染的肝细胞中已清除了病毒的共价闭合环状DNA(cccDNA)并在停止治疗后,不出现因失去机体的免疫控制而致病毒重新复制及疾病复发[3]。鉴于目前尚没有能清除肝细胞核内cccDNA的治疗技术,功能性治愈被列为较现实可及的指标,即持久的HBsAg消失(伴有或不伴有血清抗-HBs阳性),血清HBV DNA阴性,cccDNA处于非活动转录状态,停止治疗后疾病没有复发[3]。鉴于清除血HBsAg是一项功能性治愈的重要指标,而目前的治疗技术尚难以在大多数患者中实现,本文将从HBsAg入手,重点讨论乙肝的免疫治疗,探讨功能性治愈的相关问题。

HBsAg的已知与未知乙肝科学史中最早发现的是HBsAg。1963 年Blumberg在研究人类血清蛋白多态性的过程中在澳大利亚土著人中发现了一种新的蛋白(澳大利亚蛋白)。经过多年结合疾病的研究方确定为乙肝相关抗原(hepatitis associated antigen,HAA),之后通过对乙肝病毒分子生物学的研究发现乙肝病毒的包膜抗原又分为大、中、小三种类型,统称为HBsAg。在感染者的血液中以22 nm的小颗粒(又称亚病毒颗粒)居多,乙肝感染者血清中的亚病毒颗粒数远超过HBV(Dane颗粒)数,可达后者的1 000倍以上。

已知有关HBsAg的主要内容 过去与近年来的研究中,已知有关HBsAg的主要内容可归纳为:

(1) 天然或重组的HBsAg具有很强的免疫原性,在机体可诱生有保护作用的中和抗体,是全球采用的乙肝预防性疫苗。但约有1%～3%对乙肝疫苗低应答/无应答者。(2) 感染乙肝后,血清HBsAg阳性为最敏感的检测指标,但也发现有未能检测HBsAg的隐匿性乙肝感染者。(3) HBsAg中具有免疫原性的“a”决定簇已定位,但已出现一些该部位的变异株。(4) 目前治疗乙肝的方法很难清除HBsAg。(5) HBsAg可以类似外体(exosome)包有microRNA,并在细胞间传递干扰素[4-5]。(6) HBsAg具有多种抑制机体免疫功能的作用,包括抑制IL-12等[6-9]。(7) 在体外细胞及转基因鼠中HBsAg导致肝细胞分泌环孢素(cyclophilin)A从而引起炎症、上调LEF-1促进细胞增殖,影响糖及脂类代谢等[10-12]。

但迄今了解的内容仅是冰山中的一角。

对HBsAg的未知内容 对HBsAg的未知内容还有很多,主要包括:

(1) 在已发现的诸多病毒中为何仅乙肝病毒有大量的亚病毒颗粒？(2) 既然HBsAg有强免疫原性,为何在乙肝感染后是最难以清除的病毒蛋白？(3) HBsAg的致病机制有哪些？(4) cccDNA可以转录翻译不同分子与蛋白,为何HBsAg最多？(5) HBsAg与宿主间的相互作用有哪些？是否与致病相关？HBsAg与HBV其他蛋白间有无相互作用？(6) HBsAg在肝癌细胞中表达少,但在癌旁表达高,HBsAg在肝癌发生发展中起何种作用？

从乙肝发病机制与及自然发展史看乙肝治疗的“两只手” 对于慢性乙肝的治疗首先是基于对乙肝的自然病史分析、发病机制及用黑猩猩感染模型所建立的。通过分子生物学研究,HBV的复制环节、病毒的变异、进化以及机体调节病毒复制等因素已有大量发现与积累[13]。据此,已成功研发了多种抑制HBV复制的药物并取得较好的疗效。在乙肝的免疫及发病机制方面,Chisari等作出了系统的贡献[14]。通过对比急性乙肝恢复的机制,首先发现的是慢性乙肝病毒持续复制与肝内缺少特异的CD4T与CD8T细胞有密切关系。之后发现这些细胞的缺少与肝内表达的一些“检查点”(check point)的分子,如PD-1,CTLA-4,CD244及Tim-3相关。CD4 T细胞应答的缺失还表现为产生IL-2,IFN-γ低下,CD8 T细胞功能失活,Treg与分泌IL-10的T细胞在肝内聚集,构成了病毒难以清除的基础[15-16]。此外,HBV的多聚酶可抑制人体干扰素的作用,致NK细胞失活等[17]。

核苷酸类抗病毒药物 目前在我国用于治疗乙肝的核苷酸类抗病毒药物,已从最初较易出现耐药性用的拉米夫定、阿德福韦等转为较少出现耐药的恩替卡韦以及替诺福韦。这类药物主要作用于病毒的逆转录酶部分从而抑制病毒复制,可降低病毒在肝细胞内和血液内的拷贝数,也可降低肝内的炎症反应,同时会减少病毒表达的蛋白,肝内HBcAg以及血中HBeAg表达可下降,但未出现血中HBsAg的下降,也未见改善T细胞的作用。在慢性感染的细胞中,由于cccDNA处于核内,不断可被补充,即使在病毒载量很低或未被检出的情况下,还会以每细胞10～50拷贝存在。目前的核苷酸类药物不作用于cccDNA,也没有明显的调控免疫的作用。因此单用核苷酸类抗病毒药物不能达到功能性治愈慢性乙肝的目的。

alpha干扰素(IFN-α) 早在20世纪80年代初,已开始用天然和重组IFN-α治疗乙肝,因此积累了不少用IFN治疗的临床经验。IFN既具有抗病毒作用,也有一定的免疫调节作用。IFN并非直接对病毒有抑制或杀灭作用,而是通过作用于被染细胞、专职IFN生成pDC等,激活IFN受体,转录诱导出大量IFN诱导基因(ISGs),产生包括2’-5’A合成酶、核酸酶L等一系列抗RNA及DNA病毒物质而发挥抗病毒作用。虽然IFN没有针对乙肝病毒的特异性,但已证实IFN可降解HBV RNA,抑制HBV DNA复制,影响HBV核心颗粒的形成和稳定性。与核苷酸类抗病毒药物比较,IFN抑制HBV复制的效果不如核苷酸类抗病毒药物快,也不很强,但比较持久。

从免疫调节来看,IFN具有多重作用。已发现IFN可促进巨噬细胞的吞噬功能和NK细胞的活性;在用IFN治疗的肿瘤患者中,NK细胞活性增加可持续数月。IFN 还可增强免疫细胞表面表达MHC分子,β微球蛋白以及Fc受体[18]。近来还发现IFN-α在人肠黏膜中通过炎症小体可促进Th1应答及细胞凋亡[19]。

从血清HBeAg转换看核苷酸类抗HBV药物及IFN的差别 临床学者对治疗慢性乙肝认为乙肝患者病毒载量大幅度降低只能拿“铜牌”,血清HBeAg转换(HBeAg转阴并出现抗HBe)可拿“银牌”,血清HBsAg转阴并出现抗HBs才可拿“金牌”。核苷类药物一般仅能达到“铜牌”,而IFN可达“银牌”。

重视HBeAg转换的机制有其免疫学背景。一方面,HBeAg具有多种抑制机体固有免疫的作用,包括致TLR-2表达下降,对多种TLR配体的应答下降,特异抑制TLR介导的一些促炎症转录因子等[19]。另一方面,HBeAg是T细胞依赖性抗原,即抗原的免疫原性需要有功能的T细胞存在方可实现。HBeAg抗原诱生的细胞免疫主要是Th2型细胞免疫,当患者血清出现抗HBe,则反映机体的T细胞免疫功能有所改善。HBsAg也是T细胞依赖性抗原,血清HBeAg转换显示患者的T细胞免疫功能改善,可认为是发展至血清HBsAg 转阴并出现抗HBs的前哨[20]。迄今,用核苷酸类抗HBV药物治疗出现血清HBeAg转换机率低(约1%～3%),而用长效IFN治疗慢乙肝患者一年的HBeAg转换率可达30%左右。可见IFN具有的抗病毒与免疫调节两种机制的优越性。

联合和序贯治疗 近年来,国内及国际学者都在开展用核苷酸类抗病毒药物与IFN-α联合序贯治疗的临床研究,并已取得有价值的结果[21-22]。我国任红等已报道先用抗病毒治疗,将HBV载量降至最低,然后用IFN治疗,48周时的HBsAg清除率为13.2%,HBsAg血清学转换率为12.2%[23-24]。这些结果提供了抗病毒治疗与免疫治疗联合应用的效果与前景,显示了抗病毒治疗与免疫调节治疗“两只手”是不可或缺的。

乙肝免疫治疗的现状免疫治疗自2010年以来,已成为除手术、放疗、化疗等手段外,一大类发展迅速的治疗技术。但是至今免疫治疗的发展主要局限于肿瘤治疗,在治疗乙肝中,除非特异的胸腺肽以外,目前为数众多的免疫治疗技术尚处于临床研究阶段。免疫治疗可分为主动治疗与被动治疗两大类,两类均以激活机体的固有免疫或获得性免疫为目标。主动免疫的策略是通过应用制品作用于机体,激活或阻断机体免疫系统(细胞,体液,调控系统,如注射治疗性疫苗或免疫激活剂);被动免疫的策略是利用已有的制品给机体补充增强机体的免疫效应成分(细胞,体液,调控系统,例如输入改造过的免疫细胞或抗体等)。

免疫治疗的关键首先是免疫识别,然后才是免疫激活或免疫抑制,即根据疾病设计能被机体识别的外源抗原,或改造机体原来不识别的耐受原,从而激活有效的免疫应答,或抑制病理性的免疫应答。在乙肝动物模型实验中,已发现免疫细胞及细胞因子可分别通过溶细胞与非溶细胞机制作用于HBV感染细胞,这一机制可清除带有cccDNA感染的细胞,或抑制其功能,因此可有较好的疗效[25]。

由于免疫系统涉及体内多方面综合性因素,既有固有免疫、获得性免疫,又有体液、细胞免疫、细胞因子网络间相互作用等,因此免疫治疗的设计需要综合考虑多方因素。免疫治疗的难点在于:(1)具有极强的创新与探索性——有风险,也有前所未有的机遇;(2)不同制品的规范化、确定疗程、剂量、考核疗效的标准均有待建立;(3)与药物作用于病因不同,对免疫治疗的应答,个性化较药物更明显;(4)新型的免疫治疗策略,尚待被医学界及社会所认识与理解。

现有对乙肝免疫治疗的制品 目前已进行临床或临床前研究的免疫治疗乙肝制品主要包括免疫调节剂与治疗性疫苗两类。其中免疫调节剂主要有处于临床前阶段的CYT 003 (TRL-9 激动剂)、PD-1 阻断剂、刺激IFN基因激活剂;处于临床早期的Peg IFN λ、细胞因子(IL-7、12、18、21)、GS 9620 (TLR-7激动剂)等。而治疗性疫苗除了本团队研制的HBsAg-HBIG复合物型治疗性疫苗,以及古巴研制的HBsAg/HBcAg 联合(VASVAC)蛋白疫苗进入了临床Ⅲ期研究,其他还有处于临床早期的GS 4774(tarmogen)、HB110、T细胞多肽epitome、DV601、TG1050 (transgene)、GI 13020等在研的候选产品,以及尚在临床前的DNA 疫苗[26]。

HBsAg-HBIG治疗性乙肝疫苗(乙克) 乙肝治疗性疫苗属主动免疫范畴的免疫治疗,是多种抗持续性感染的治疗性疫苗中研发最快的一种。基于对HBV造成持续性感染机制的研究,本团队早在20世纪80年代中期以HBsAg为对象,旨在打破患者对HBsAg的免疫耐受,设计了HBsAg-HBIG复合物型治疗性疫苗“乙克”[27]。在1988年,国家“863”高科技计划即给予了这一课题大力支持,一直持续至十一、十二五国家传染病重大专项。而20世纪80年代美国学者们却以HBcAg为靶点,试图以此抗原为突破口,清除HBV感染细胞,但临床研究以失败而告终[28-29]。法国学者则开展了以S/Pres的DNA乙肝免疫治疗技术,虽然出现了T细胞功能改善的实验依据,但临床试验即使加上核苷类抗病毒药物也未能显示疗效[30-31]。复合物型乙肝治疗性疫苗(乙克)的研究已走过了近30个春秋。在众多优秀同仁以及患者的共同努力下,1988年开始做动物实验,1993年申请专利,1997年专利获批准,2003年获准开始临床试验。Ⅰ期临床研究在正常人中免疫后证明可首胜有效的体液及细胞免疫[32];Ⅱ期随机双盲对照的临床研究在242名HBeAg阳性患者中进行,每月注射1次,共注射6次,随访6个月,乙克60 μg免疫组HBeAg血清转换达21.7%,类似IFN治疗1年的效果,与对照组(注射氢氧化铝组)相比差异有统计学意义[33];Ⅲ期临床试验第一阶段在450名慢性乙肝患者中进行,治疗方案改为12针,结果因连续注射1年引起了免疫疲劳,乙克60 μg免疫组HBeAg血清转换率降为14.0%,而氢氧化铝组则升至21.9%[34]。通过动物实验证实用乙克过度免疫所致的免疫疲劳,表现为细胞免疫功能下降;然而氢氧化铝所激活的固有免疫却可通过增强炎症反应而显出一定疗效[35]。近年来已发现氢氧化铝具有明显的激活机体固有免疫[36]。因此,目前乙克的临床研究中,实际上氢氧化铝并非是空白对照,而是固有免疫激活剂。

在目前正在进行的Ⅲ期临床试验第二阶段,将在480名慢乙肝患者中重新进行乙克与氢氧化铝6针1∶1的双盲研究,以确证乙克的疗效。在推进Ⅲ期临床试验第二阶段研究的同时,本课题组完成了一项用阿德福韦为基础治疗,针对乙克治疗机制的小规模临床研究,发现乙克免疫6针组CD4+T细胞的Th1、Th2细胞升高,伴有Treg细胞下降。CD8+T细胞中Tc1和Tc17 c细胞升高。对38种细胞因子的分析,乙克免疫组的CD4+T细胞IL-2与IFN-γ升高,抑制因子(IL-10,TGF-β和Foxp3)下降[37]。

理想方案与最佳方案面对功能性治愈慢性乙肝,目前多种治疗乙肝的针对HBV的药物、制剂,包括阻断病毒入侵细胞、抑制核衣壳、抑制病毒多聚酶的末端蛋白、RNAse H、抑制HBV/HBsAg分泌与释放,特别是针对cccDNA,使其静化(silencing)或减少其转录、翻译等药物均在积极研发中[38]。由于cccDNA存在于肝细胞核内,如何保证药物可及,以及避免对细胞的损伤,将是需要考虑的问题。此外,在cccDNA转录与翻译的几种病毒蛋白中是否亚病毒颗粒的合成与释放有其特点,目前尚属空白。这些基础性研究在功能性治愈中应有所重视。

目前,多种免疫治疗也是研究热点,其中包括中和作用的单克隆抗体,改造免疫细胞(如CAR-T),针对TLR的激活剂,多重抗原组成的治疗性疫苗,GMCSF结合疫苗治疗等以及上述抗病毒药物结合IFN的联合序贯治疗等都是选项[39]。

治愈乙肝的理想方案是完全清除HBV感染的细胞及清除cccDNA、患者的肝功能恢复正常、避免发生肝硬化与肝癌。但是目前尚需长期研究。根据现有积累的数据与结果,目前可以考虑采用最佳方案,以清除HBsAg,并使患者产生持久的抗HBsAg的免疫。

鉴于核苷类抗病毒药物可清除患者体内HBV DNA,在动物实验中注入中和性HBsAg抗体可以在一定时间内有效降低或清除血液中的HBsAg[40-42],用HBIG可防止肝移植后乙肝的复发;HBsAg-HBIG作主动免疫可以诱生机体CD4、CD8细胞应答及降低Treg等。目前建议清除HBsAg的“三明治”方案:第一层用抗病毒药物降低病毒载量,第二层用现有的具有中和作用的抗HBs抗体被动免疫,降低患者体内的HBsAg,待HBsAg降至很低或不可测及,第三层用具有强免疫作用的HBsAg-HBIG复合物型疫苗主动免疫[43]。

当患者体内已不再有可测及的HBV DNA与HBsAg,可能会与接种预防性疫苗一样,产生有效的针对HBV的抗体与细胞免疫。这个方案是否为目前可行的最佳方案有待于科研学者、临床学者以及管理专家们讨论,优化后付诸实施,予以考核。

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HepatitisBsurfaceantigenandfunctionalcureofchronichepatitisB

WEN Yu-mei△, WANG Xuan-yi

(MoE/MoHKeyLaboratoryMedicalMolecularVirology,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Functional cure of viral hepatitis B is currently the main target of scientists worldwide.The definition of functional cure is durable loss of HBsAg (with or without HBsAg sero-conversion),undetectable serum HBV DNA,persistence of cccDNA in an inactive state and the absence of spontaneous relapse after treatment cessation.In this article,the knowns and unknowns of HBsAg have been shortly reviewed,and current immunotherapies for chronic hepatitis are introduced.Among these,the experimental and clinical application of HBsAg-HBIG immunotherapy developed by our group is presented.Based on the current data,as anti-HBV drugs can eliminate or decrease viral load,neutralizing HBsAg antibody can provide passive immunity,and HBsAg-HBIG complexes can trigger potent immune responses,a “sandwich” protocol for functional cure of chronic hepatitis B is proposed.Namely,first use anti-HBV drugs for decrease or elimination of viral load; second,use passive immune therapy,by neutralizing anti-HBs antibody for decrease or clearance of serum HBsAg; and lastly,use active immunization,by HBsAg-HBIG complex vaccination to induce long term and effective immune responses to HBsAg.This approach may keep cccDNA in an inactive state,and reach the goal of functional cure.

chronic hepatitis B; hepatitis B surface antigen; therapeutic vaccine; cure

R373

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.06.005

△Corresponding author E-mail:ymwen@shmu.edu.cn

2017-08-14;编辑:张秀峰)