电针对2型糖尿病大鼠右心房自主神经损害的调节作用

祝恩智，李南溪，张 宇，高婉宁，王洪峰，逄紫千

（长春中医药大学, 长春 130117）

电针对2型糖尿病大鼠右心房自主神经损害的调节作用

祝恩智，李南溪，张 宇，高婉宁，王洪峰，逄紫千*

（长春中医药大学, 长春 130117）

目的 探讨针刺对2型糖尿病大鼠右心房自主神经损害的调节水平，为针刺临床优化选穴提供参考依据。方法 60只SD雄性大鼠随机分为4组，空白对照组、DM模型组、电针1组、电针2组。除空白对照组外，其余3组给予高脂高糖喂养4周后，用STZ 25 mg/kg连续2 d腹腔注射制作实验性糖尿病大鼠模型。造模2周后，空白对照组和DM模型组不予治疗；电针1组：选内关、曲池、后三里、三阴交；电针2组：选肺俞、心俞、胰俞、脾俞、肾俞，1次/d，6 d为1个疗程，连续治疗4个疗程，疗程间休息1 d。Elisa法检测4组大鼠右心房心肌中酪氨酸羟化酶（TH）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）、神经生长因子（NGF）、生长相关蛋白- 43（GAP- 43）、睫状神经生长因子（CNTF）等含量。结果 与空白对照组比较， DM模型组ChAT显著下降（p＜0.05），NGF有明显上升（p＜0.05），GAP- 43和CNTF有明显下降（p＜0.05）；与DM模型组相比较，2个电针组的ChAT有明显上升（p＜0.05），NGF有明显下降（p＜0.05），GAP- 43和CNTF均有明显上升（p＜0.05），且电针1组优于电针2组。结论 电针肢体腧穴对DM模型大鼠FPG有良好的调整作用，电针能够良性调节右心房TH、ChAT、NGF、GAP-43、CNTF的水平，减轻心脏自主神经纤维损害程度，且肢体腧穴组优于背俞穴组。

2型糖尿病；心脏自主神经病变；电针疗法

糖尿病心脏自主神经病变（DCAN）是糖尿病的严重并发症之一，但早期因没有临床症状或症状不典型而未引起足够的重视。DCAN患者发生房颤、室性心律失常和无痛性心肌梗死的危险性明显多于未并发DCAN的患者。针灸对糖尿病具有良好的治疗优势，但针灸调节DM模型大鼠并发DCAN的研究还较少。项目组对针灸治疗糖尿病的处方进行优化，并对肢体选穴和躯体选穴（背俞穴）2种腧穴配伍方法对比观察，采用ELISA法检测大鼠右心房心肌中的TH、ChAT、NGF、GAP- 43、CNTF的含量，旨在揭示针灸对DCAN心脏自主神经损害的调节水平，并选出最简便的腧穴配伍规律，为DCAN的早期临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用SPF级健康雄性SD大鼠60只，8周龄，体质量200～220 g，动物许可证号：SCXK（辽）2015-0001。分笼饲养，每笼5只，室温（22±2）℃，相对湿度30%～40%，昼夜循环通风，自由摄食和水。本组动物实验经过我校动物伦理委员会评估合格。

1.1.2 主要试剂 链脲佐菌素（STZ）（美伦生物出品，Lot:M0222A，储存条件：2～8 ℃）；ChAT、TH、TGF、GAP- 43、CNTF 5种ELISA检测试剂盒（美国R&D公司，国内分装，批号：20161215）。

1.1.3 仪器设备 酶标仪（型号：SynergyMx/SMA）；血糖仪（型号：HEA-STP30）；血糖试纸（批号：161653111B）；电子针疗仪（型号：SDZ-V）。

1.2 方法

1.2.1 造模与分组 SD雄性大鼠60只，适应性喂养1周，随机分4组：空白对照组，DM模型组，电针1组,电针2组，每组15只。DM模型制备方法[1]：空白对照组给予纯净水和大鼠正常维持饲料，其余3组大鼠给予含10%高脂+ 0.4%胆酸盐的饲料和10%葡萄糖纯净水喂养。4周后给予STZ（临用前用pH值4.2～4.5的0.1 mol/L柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液避光条件下配成1%浓度溶液）25 mg/kg连续2 d腹腔注射，空白对照组大鼠给予等量，相同方法柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液腹腔注射以平衡实验。 STZ注射后3 d测随机血糖（RBS）和空腹血糖（FPG），以RBS ＞ 11.1 mmol/L作为成模标准[1]。

1.2.2 针刺治疗分组及选穴 空白对照组：不做任何处理；DM模型组：参加模型复制，但不做针刺治疗；电针1组：参加模型复制，针刺：内关、曲池、后三里、三阴交；电针2组：参加模型复制，针刺：肺俞、心俞、胰俞、脾俞、肾俞。大鼠腧穴定位标准参照《实验针灸学》[2]。

1.2.3 针刺方法 电针1组取仰卧位，电针2组取俯卧位。直刺进针，平补平泻，加电针，使用疏密波，脉冲强度8 Hz。1次/d，20 min/次，6 d为1疗程，连续治疗4个疗程，疗程间休息1 d。

1.2.4 生化检测方法 4组大鼠隔夜禁食，次日测量FPG，1.5%戊巴比妥钠，30 mg/kg腹腔注射麻醉，组织剪开胸，立即剪取大鼠右心房，称取0.2 g心肌组织，组织剪剪碎，加入2 mL 4 ℃的0.9%氯化钠溶液，冰水浴匀浆1 min（5档），制备10%心肌组织混悬液，4 ℃，3 000 r/min，15 min，取上清液，用蛋白定量试剂盒进行定量，并调整总蛋白浓度。采用ELISA法检测TH、ChAT、NGF、GAP-43、CNTF含量，方法参照试剂盒说明书。标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL。样本孔先加待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL,空白孔不加。标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL， 37 ℃恒温箱60 min。弃去液体，加入洗液，洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，在15 min内，将试剂盒放在酶标仪中，在450 nm波长处测定OD值。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料均采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用χ2分析，p＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌中TH、ChAT含量比较 见图1。

2.2 各组心肌中NGF、GAP-43、CNTF含量比较 见图2。

图1 各组大鼠右心房TH、ChAT含量变化

图2 各组大鼠右心房NGF、GAP-43、CNTF含量变化

3 讨论

糖尿病患者出现心脏自主神经症状的概率为20 % ～80 %[3]，而且在早期就会出现，但症状隐匿不易被发现[4]。糖尿病患者短期连续测量血糖变异及2年糖化血红蛋白变异监测均与DCAN有明显相关，证实短期和长期糖尿病均可引起DCAN，且失神经支配和交感-迷走失衡存在时间依赖性[5-9]。本项目组研究高脂高糖诱导4周，STZ腹腔注射6周时，DM大鼠右心房TH、ChAT、NGF、GAP-43、CNTF的含量特征和电针调节水平。DM大鼠表现为体质量上升缓慢，FPG和RBS显著上升，麻醉状态下心率明显下降。

本项目组突破传统的循经取穴原则，根据病证部位结合腧穴所在神经节段性分布的特点进行选穴。电针1组选取上肢C5～T1，下肢L2～S2的肢体腧穴。曲池属手阳明大肠经，后三里属足阳阳胃经，二穴合用取治痿独取阳明之意；内关为手厥阴心包经络穴，三阴交为足三阴经的交汇穴，二穴相配可补益心肾，养血柔筋。4穴远近相配，标本兼治，增强腧穴配伍的协同效应，起到疏通经络，滋阴壮元的作用。电针2组选取T1～L2的背俞穴，背俞穴是脏腑之气输注背腰部的穴位，取其“从阳引阴，阴病治阳”的腧穴固有生物学特性，起到培本固元，滋阴生津的作用。本实验的2组选穴大致处于相同的神经节段，2电针组均有效，提示2组选穴均对DM大鼠右心房自主神经有良性的调节作用。

TH是哺乳动物体内儿茶酚胺类神经递质生物合成途径的限速酶，是交感神经分布的标记物。ChAT是合成乙酰胆碱（Ach）过程中重要的酶，为胆碱能神经元的标记物。

本组DM大鼠在麻醉状态下，由于对低血容量的代偿能力降低而表现为心率明显下降。与正常对照组比较，DM模型组大鼠ChAT显著下降，TH含量有上升趋势，但无统计学意义；经过4周的电针治疗，与DM模型组比较，2个电针组ChAT明显上升。提示DM大鼠自主神经以迷走神经纤维损害为主，交感神经纤维损害程度轻，表现为相对增生，与文献[10]报道相符合，而电针对于病理性降低的ChAT具有良性上调的作用。内关穴是治疗三焦病症的要穴，对心、胸、胃、神经性疾病起到“调虚实，平阴阳”的“双向性保护调和效应”[11]。肺俞和心俞靠近脊髓胸段交感干，交感去甲肾上腺素能纤维和副交感胆碱能纤维支配心房、心室、窦房节、房室结、束支和气管支气管的扩张和收缩。故笔者根据实验结果推测，电针内关、肺俞、心俞对TH和ChAT的表达有相关性。

NGF能够维持交感神经的生存和再生，阻止或减轻神经元退变并能诱导损伤或病患神经元的再生[12]，其过度表达会导致交感神经发生异常增生[13]。实验发现与正常对照组比较，DM模型组NGF显著上升，与TH含量变化趋势一致。与DM模型组比较，2个电针组NGF明显下降，提示这一时期，交感神经也存在受损和重构现象，电针治疗可以抑制NGF的过度表达。

GAP- 43是促进轴突生长及神经细胞分化的蛋白质，通过抑制细胞调亡参与损伤的修复[14]，对交感和迷走神经均有修复作用。CNTF可以阻止交感神经细胞的增殖并促进其分化，而且还是交感神经元的胆碱能分化因子，即CNTF能通过提高ChAT而降低TH的水平，将肾上腺能神经元转变为胆碱能神经元[15]。电针内关、足三里、三阴交等腧穴能够增强相应神经节段及中枢组织中GAP- 43的表达[16-17]。实验结果显示，DM模型组ChAT、GAP- 43、CNTF阳性表达明显低于正常对照组，提示迷走神经纤维退行性减少促进神经元再生能力下降。

本项目组所选2组腧穴均对DCAN大鼠的体质量、血糖、心率等具有调节作用，对右心房自主神经具有良性修复作用。电针治疗4周后，2个电针组NGF均明显下降，ChAT、CNTF、GAP- 43明显上升，电针1组优于电针2组。提示对于DCAN的针刺治疗方案优选肢体选穴组。笔者在治疗心脏自主神经病变时，除考虑减轻神经损伤选取阳明经腧穴外，还以调整心脏交感-迷走神经平衡为重点选取心包经腧穴及背俞穴，对减轻心脏自主神经重构过程中出现的交感-迷走失衡状态，维持交感神经和迷走神经对心脏的平衡支配起到了有效的双向调和作用。本实验研究为临床预防、治疗DCAN提供了有效的实验依据，为减少其他神经系统疾病引起的自主神经病变的针灸治疗提供选穴思路。

参与文献：

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Regulating effect of electroacupuncture in the right atrium autonomic nerve damage of type 2 diabetic rats

ZHU Enzhi, LI Nanxi, ZHANG Yu, GAO Wanning, WANG Hongfeng, PANG Ziqian*
(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun130117, China)

Objective To investigate the regulating effect of electroacupuncture on the autonomic neurotrophic factor in the right atrium of type 2 diabetic rats, and to provide reference for electroacupuncture clinical optimization.Methods Sixty SD rats were randomly divided into four groups: blank control group, DM model group,electroacupuncture group 1 and electroacupuncture group 2. Except the blank control group, the other three groups were fed with high fat and high glucose for 4 weeks. The experimental diabetic rats were injected intraperitoneally with STZ for 2 days at 25 mg.kg-1. After 2 weeks of modeling, the blank control group and DM model group were not treated; electroacupuncture 1 group: select Neiguan (PC6), Quchi (LI11), Zusanli (ST36), Sanyinjiao (SP6);electroacupuncture 2 group: select Feishu (BL13), Xinshu (BL15), Yishu (EX-B3), Pishu (BL20), Shenshu(BL23).Once a day, six days for a course of treatment, continuous treatment for four courses, one-day rest between the courses. TH, ChAT, NGF, GAP-43, and ciliary, Nerve growth factor (CNTF) in the right atrium of rats were assessedwith ELISA. Results ChAT of DM group decreased signif i cantly (p＜0.05), NGF was increased signif i cantly (p＜0.05),GAP-43 and CNTF were signif i cantly decreased (p＜0.05) in the DM model group compared with the control group;the ChAT of the two electroacupuncture groups increased signif i cantly (p＜0.05) NGF decreased signif i cantly (p＜0.05),GAP-43 and CNTF were signif i cantly increased (p＜0.05) compared with DM model, electroacupuncture group 1 was superior to electroacupuncture 2 group. Conclusion Electroacupuncturing on limbs has a good effect on FPG of DM model rats, electroacupuncture can regulate the right ventricular autonomic neurotrophic factor balance, reduce the degree of autonomic nerve fi ber damage and group of limbs acupoints better than that of group of back transport points.

type 2 diabetes; cardiac autonomic neuropathy; electroacupuncture

R245

A

2095-6258(2017)06-0893-04

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.011

2017年国家自然科学基金资助项目（81674051）;2016年吉林省教育厅“十三五”科研课题（01080864）;2017年大学生创新创业训练计划(国家级)（201710199002）;2016年吉林省高等教育学会高教科研课题（JGJX2016C17）。

祝恩智（1968 -）,男,硕士,副研究员,主要从事中医药实践教学管理模式的理论研究。

*通信作者：逄紫千,女,硕士,正高级实验师,电子信箱 - ziqianp@126.com

2017-09-17）