苦瓜总皂苷对阿霉素肾病大鼠P-GSK-3β表达的影响

王 玲，吴秋枫

（武汉科技大学附属天佑医院中医科,武汉 430064）

苦瓜总皂苷对阿霉素肾病大鼠P-GSK-3β表达的影响

王 玲，吴秋枫*

（武汉科技大学附属天佑医院中医科,武汉 430064）

目的 分析苦瓜总皂苷对阿霉素肾病大鼠磷酸化糖原合成酶激酶-3β（P-GSK-3β）表达的影响。方法 50只SD大鼠随机分为空白组、模型组、苦瓜总皂苷低、中、高治疗组,造模成功后给予8周治疗后处死大鼠,观察肾脏病理学,肾功能及P-GSK-3β的表达。结果 与空白组相比,模型组12 h蛋白定量、BUN、Scr、TG和CHO增加（p＜0.05）,苦瓜总皂苷治疗组相较于模型组下降（p＜0.05）;与空白组相比,模型组TP、ALB、Bax和Bcl-2降低（p＜0.05）,苦瓜总皂苷治疗组相较于模型组升高（p＜0.05）;组织病理学检测,空白组肾脏无异常,模型组上皮细胞明显变性,苦瓜总皂苷治疗后明显改善;与空白组相比,模型组P-GSK-3β大量表达（p＜0.05）,苦瓜总皂苷治疗组相较于模型组明显降低（p＜0.05）。结论 苦瓜总皂苷可改善阿霉素肾病大鼠肾功能,与其可降低肾脏P-GSK-3β表达有关。

苦瓜总皂苷;阿霉素肾病;磷酸化糖原合成酶激酶-3β

肾病综合征是临床中常见的一种疾病，临床主要表现为大量蛋白尿、高脂血症及低蛋白血症等，本病在发生后危害极大，因此关于本病药物开发受到了众多学者的关注[1-2]。临床中本病的治疗主要有激素疗法、激素和细胞毒药相结合以及免疫抑制剂疗法等[3-4]，不可否认，采用上述方法治疗周期长、同时患者容易产生耐药性，因此需积极开发本病的救治药物。苦瓜总皂苷是近年来研究较为广泛的药物，其在糖尿病、肾病等多种疾病中都有一定的治疗作用[5-7]。本次研究采用苦瓜总皂苷治疗本病，旨为今后苦瓜总皂苷的开发和本病的治疗提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料 选取雄性SD大鼠50只，体质量160～180 g，购于湖北中医药高等专科学校实验动物中心 SCXK（鄂）2014-0017。TP、SCr、BUN、Alb、TG和CHO试剂盒购于南京建成生物；Bax和Bcl-2试剂盒购于上海恪敏生物科技；P-GSK-3β抗体和ECl化学发光试剂盒购于美国Santa，二抗购于中山金桥，引物购于上海生物生工。

1.2 方法 50只大鼠随机分为空白组、阿霉素肾病组（模型组）、苦瓜总皂苷低、中和高剂量治疗组，每组10只。阿霉素肾病大鼠模型的构建参照文献[8]进行。治疗时苦瓜总皂苷低、中、高剂量组分别给药10、20、40 mg/kg苦瓜总皂苷，空白组和模型组则给予1 mL生理盐水灌胃，治疗8周后处死大鼠，进行实验。

1.3 标本收集 1）12 h尿和血标本：于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9周后对大鼠12 h尿液收集标本后置于EP管。大鼠麻醉后，暴露心脏用注射器抽取即可，后置于离心机中3 000 r/min离心，取上清液保存备用。2）肾脏标本：血液收集后摘取双侧肾脏，统一切取左肾一半置于4%多聚甲醛中用于组织学检测，其余置于超低温冰箱中保存。

1.4 观测指标及方法 1）一般情况：在整个造模和治疗过程中对饮食量进行统计，密切监视其精神状态，大小便等。根据公式：12 h尿蛋白排泄量（rag）=12 h尿蛋白浓度（mg/mL）×12 h尿量（mL）计算。2）血清生化指标：TP、SCr、BUN、Alb、TG和CHO等检测仪器为分光光度计，肾脏组织中Bax和Bcl-2检测检测仪器为酶标仪。3）HE染色：HE染色参照文献[9]进行。4）蛋白表达：将100 mg肾脏组织置于1 mL总蛋白提取液中，撵磨后提取上清液定量调平，每组各取40 μg进行凝胶电泳后半干转移法转膜，脱脂牛奶密封2 h后洗涤3次，加入1抗过夜洗涤3次后加入2抗密封2 h，ECL发光显色，完成后扫描图像，Image J计算灰度值。3）半定量PCR：取30 mg肾脏组织提取总RNA，提取后定量调平逆转录，扩增（95 ℃5 min，94 ℃变性60 s，65 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35个循环，72 ℃ 5 min）。完成后，取5 μL电泳，最后收集图像， image J计算灰度值。

1.5 统计学方法 统计学软件为SPSS 20.0，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用Pearson相关分析，检验水平P= 0.05。

2 结果

2.1 大鼠一般状况 空白组大鼠精神佳，饮食正常，模型组出现不同程度的动作迟滞、精神萎靡、饮食下降；治疗2周后，3个治疗组明显好转。

2.2 12 h尿蛋白定量结果 由表1可明显看出，空白组12 h蛋白定量较低，其余4组第2周开始明显高于空白组，模型组一直呈明显增加，3个治疗组4周后明显下降。

表1 各组别大鼠12 h尿蛋白排泄量比较（x± s ，n = 10）

2.3 生化检测结果 见表2。

表2 大鼠肾功能检测比较（x± s ，n = 10）

2.4 Bax和Bcl-2的测试结果 见表3。

表3 大鼠肾脏组织Bax和Bcl-2测试结果（x± s ，n = 10） ng/L

2.5 病理染色观察 HE染色空白组大鼠肾脏无异常，而模型组则上皮细胞发生明显变性，同时有轻微间质纤维化，苦瓜总皂苷治疗后，有明显的改善，且改善趋势随着药物浓度的增加更为明显。

2.6 Western bloting和半定量PCR检测 Western bloting和半定量PCR检测呈现出基本一致的结果，空白组P-GSK-3β蛋白和mRNA较少，而模型组则明显呈现出高表达，苦瓜总皂苷治疗后，相较于模型组，其表达量明显降低，且随着给药剂量的增加，其表达呈明显的剂量依赖性。见表4。

表4 大鼠心肌组织中P-GSK-3β蛋白和mRNA相对表达（x± s ，n = 10）

3 讨论

苦瓜是人们非常喜爱的一种蔬菜。现代医学研究[10]发现，苦瓜具有很好的降糖疗效，甚至优于目前常用的降糖药物甲糖宁，许多学者[11-13]均采用苦瓜提取物研究降糖作用，且收到了较好的效果。苦瓜总皂苷是目前基础研究中研究较多的苦瓜提取物，已有研究[14]发现，苦瓜总皂苷除具有降低血糖外，还具有明显保护肝脏和肾脏作用，另外，利尿效果也非常好。本次研究笔者使用苦瓜总皂苷治疗阿霉素肾病大鼠，研究发现，苦瓜总皂苷对其12 h尿蛋白水平具有明显的降低作用，但是降低作用和空白组差异较大，此外结合苦瓜总皂苷具有一定的改善肾功能的作用，提示苦瓜总皂苷对阿霉素肾病大鼠具有一定的保护作用，但并不能专一治疗本病。

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是在进化中非常保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，其普遍存在于真核细胞[16]。一般而言，GSK-3并不发挥作用，但当其受到磷酸化反应，变成磷酸化糖原合成酶激酶-3β（P-GSK-3β） 后，则可发挥作用，主要为调节细胞分化、增殖以及凋亡等，特别是其对凋亡的控制作用，目前已经受到了众多学者的研究[16-17]关注。Bax和Bcl-2是细胞凋亡的2个关键蛋白，二者直接决定肾脏细胞的凋亡，其中Bcl-2主要在线粒体外膜分布，其与Bax结合后可达到抗凋亡[18-19]。本次研究发现，使用苦瓜总皂苷治疗阿霉素肾病大鼠，可明显降低Bax、提高Bcl-2表达，提示苦瓜总皂苷具有很好的抗肾脏凋亡作用，分析其机理，可能与其能降低肾脏中P-GSK-3β的表达有关。

综合提示，苦瓜总皂苷可改善阿霉素肾病大鼠肾功能，这与其可降低肾脏P-GSK-3β表达有关。

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Effects of momordicosides to P-GSK-3β in rats with adriamycin nephropathy

WANG Ling, WU Qiufeng*
( Department of Traditional Chinese Medicine, Tianyou Hospital, Wuhan University of Science and Technology,Wuhan 430064, China )

Objective To study the effect of momordicosides to P-GSK-3β in rats with adriamycin nephropathy.Methods 50 SD rats were randomly divided into blank group, model group, low, middle and high momordicosides dose treatment group, after built model, renal pathology, renal function and P-GSK-3β were detected.Results Compared with the blank group, the quantitative of 12 h protein, BUN, Scr, TG and CHO in the model group were signif i cantly higher (p＜0.05), above mentioned indicators were lowed in momordicosides group compared with the model group (p＜0.05). Compared with the blank group, the levels of TP, ALB, Bax, and Bcl-2 were signif i cantly low (p＜0.05), compared with the model group, they were higher in momordicosides treatment group(p＜0.05). Histopathological can be seen, there is no abnormality in the blank group, the epithelial cells were obviously denatured in the model group, after using momordicosides, it was signif i cantly improved. Compared with the blank group, the expression of P-GSK-3β was significantly lower in the model group than in the model group (p＜0.05), the momordicosides was significantly improved compared with the model group (p＜0.05).Conclusion Momordicosides can improve the renal function of rats with adriamycin nephropathy, which may be related with it can decrease the expression of P-GSK-3β.

momordicosides; adriamycin nephropathy; P-GSK-3β

R915

A

2095-6258(2017)06-0871-04

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.004

湖北省科技厅创新项目（2015CFC187）。

王 玲（1982 -）,女,主要从事中医基础与临床研究。

*通信作者：吴秋枫,女,主任医师,电话 - 13638642330，电子信箱 - hb70521@126.com

2017-02-17）