亚砷酸钠致小鼠乳腺癌作用机制研究

董 雪，曹 阳，李 婷，苗晨曦，阎 琪

（长春中医药大学,长春 130117）

亚砷酸钠致小鼠乳腺癌作用机制研究

董 雪，曹 阳，李 婷，苗晨曦，阎 琪*

（长春中医药大学,长春 130117）

目的 研究亚砷酸钠（NaAsO2）对小鼠乳腺上皮细胞（NMuMG）的影响,为砷致乳腺癌机制提供理论依据。方法 以小鼠乳腺上皮细胞为模型，研究亚砷酸钠对乳腺上皮细胞形态的影响；经流式细胞仪检测亚砷酸钠对小鼠乳腺上皮细胞凋亡的影响；实时定量RT-PCR 检测细胞周期基因P21 mRNAs表达水平。结果 NaAsO2对NMuMG具有毒性效应，在一定浓度范围内，随NaAsO2浓度升高，细胞形态明显改变，凋亡明显增多，且呈剂量-效应关系；细胞增殖的抑制基因P21 mRNA水平增高了18.12倍。结论 亚砷酸钠可能通过上调P21基因的表达来抑制NMuMG增殖,可能是砷中毒引起乳腺癌的发生机制之一。

亚砷酸钠；增殖；P21基因；乳腺癌

乳腺癌是常见的恶性肿瘤，是妇女死亡的第二位原因，在过去的50年间，其发病率逐步提升[1-2]。目前已经证明，长期接触砷可以增加人类肿瘤的发病率。美国环境保护协会和国际癌症研究中心（IARC）已将砷列为Ⅰ类致癌药物[3-4]。流行病学[5-7]调查显示，地砷病区其乳腺癌的发病率高于其他地区。由于砷致癌机制十分复杂，目前不是十分清楚，在研究砷致癌机制及与乳腺癌的关系之前，笔者先观察了亚砷酸钠对小鼠乳腺上皮细胞（NMuMG）的直接毒性效应，观察在所常见的剂量范围内，对NMuMG的形态凋亡等影响。

1 材料与方法

1.1 材料 亚砷酸钠（NaAsO2）、胰岛素，购于SIGMA公司；小鼠乳腺上皮细胞（NMuMG）由瑞典大学ARIS教授友情馈赠，Dulbecco’s Modif i ed Eagle Media，DMEM培养基购自Gibco公司；优级胎牛血清购自北京元亨金马生物公司；CCK-8试剂盒购自于碧云天公司；Trizol试剂盒、RT-PCR 试剂盒购自Takara公司；2 ×SYBR Green Ⅰ试剂购自ABI 公司。Real time-PCR 仪为美国 ABI7300。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 NMuMG培养在含10 %胎牛血清及10 μg/mL胰岛素的DMEM 培养基中，置于37 ℃、5 %CO2恒温培养箱中培养。

1.2.2 细胞形态的观察 将处于指数增长期的NMuMG，制成单细胞悬液，以5×104/mL的密度接种于6 cm的培养皿中，加入2.5 mL培养基，待细胞长至70%～80%融合后，换以不同浓度的NaAsO2溶液，继续培养24 h后，利用共聚焦显微镜观察细胞形态的改变，并照相。

1.2.3 NMuMG的细胞凋亡测定 各组细胞经不同浓度的NaAsO2作用24 h后，用胰酶进行消化，收集之后，分别放再2.0 mL的EP管中，2 000 r/min离心5 min；用事先4 ℃预冷的0.1 mol/L PBS溶液洗涤细胞3次；加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入 5 μL Annexin V-FITC 混匀；4℃ 避光 ,孵育 15 min；再加入10 μL PI,混匀；室温避光，孵育5 min；注意：4组用0 μmol/L NaAsO2处理过的细胞分别加入的是①不加Annexin V-FITC和PI、②加Annexin V-FITC、③加PI、④加Annexin V-FITC和PI。在1 h内，进行流式细胞仪的观察和检测；用流式细胞仪分析检测，激发波长488 nm，发射波长530 nm。

1.2.4 实时定量RT-PCR检测 分别按照产品说明书，应用Trizol 试剂提取细胞总RNA。应用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA（具体操作步骤均按厂家产品说明书进行），其反应条件：30 ℃、10 min，42 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min。c-myc、 c-jun 采用实时定量RT-PCR（SYBR Green 法）进行。反应程序为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；92 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s，共50 个循环。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列见表1 。

表1 PCR扩增所用引物

1.3 统计学方法 所有数据采用SPSS 10.0统计学软件进行处理，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，多组数据间两均数的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下细胞形态的改变 首先从形态上，利用共聚焦显微镜观察不同浓度的亚砷酸钠对NMuMG的影响，DIC照相。0 μmol/L对照组细胞呈铺路石、上皮细胞形状，细胞间连接紧密，细胞贴壁生长，状态较好；经亚砷酸钠作用24 h后，随着亚砷酸钠浓度的提高，细胞间隙逐渐变宽，细胞变长、形状不规则，有空泡出现，漂浮的死细胞越来越多。

2.2 NaAsO2引起NMuMG凋亡的测定 用AnnexinV、PI双染法检测细胞凋亡，按照流式细胞仪获取的10 000个细胞散点图进行分析，Q3区域内为正常细胞，Q4区域内为早期凋亡细胞，Q2区域内为坏死细胞和凋亡末期的细胞。凋亡率（%）= Q2+Q4。在不同浓度NaAsO2作用于细胞后，随着药物浓度增加，凋亡细胞数量也明显增多。NaAsO2浓度从5 μmol/L开始，与0 μmol/L组相比有显著差异（P＜0.05），且随着浓度的升高，凋亡的细胞越来越多，且有剂量-效应关系。（见图1）。

2.3 NaAsO2促进P21的mRNA表达水平 P21基因是抑制细胞增殖的基因，其表达水平的增高，代表细胞增殖受到抑制[8-10]。经20 μmol/L的亚砷酸钠处理NMuMG 24 h后，收集细胞，提取RNA，实时定量RT-PCR检测。实验所得结果均经过内参及未处理组校正过，独立实验重复3次，每次2个复孔。结果显示：经20 μmol/L亚砷酸钠处理的NMuMG，其抑制基因P21的mRNA表达水平明显升高，升高18.12倍，统计学上均有统计学意义（P＜0.01 ），结果说明亚砷酸钠对NMuMG增殖的抑制作用是通过P21途径实现的。

3 讨论

中国一直是饮水型地砷病严重的国家，云南、新疆、吉林等10余省份均是污染大省[11-12]。在地砷病区，女性乳腺癌的发病率呈直线上升，严重威胁女性健康[13]。为了解砷致乳腺癌发病机制，本研究以NMuMG为实验对象，观察亚砷酸钠对其毒性作用。

图1 NaAsO2引起NMuMG细胞凋亡

本研究发现经NaAsO2处理后，NMuMG形态明显发生改变，细胞形态不规则，细胞间隙扩大，且随着亚砷酸钠浓度的升高，凋亡的细胞越来越多。并发现NaAsO2对NMuMG的增殖具有明显的抑制作用，呈典型的剂量-效应关系。

P21是一种细胞周期素依赖性激酶的抑制蛋白，通过抑制多种 Cyclin/CDK 复合物的活性来调节细胞周期，使细胞周期延长，进而抑制细胞增殖[14]。通过RT-PCR方法检测P21基因表达水平，笔者发现经20 μM浓度亚砷酸钠处理的NMuMG，其抑制基因P21的mRNA表达水平升高18.12倍，说明NaAsO2对NMuMG的增殖抑制作用是通过促进P21表达而实现的。

许多实验都表明，砷化物是通过对抑制细胞的增殖，引起凋亡来发挥其毒性作用的[15-16]。通过消化系统长期摄入低剂量的砷化物，发现可以引起大鼠膀胱癌，且主要是引起膀胱上皮细胞的坏死和凋亡[16]。本研究通过观察不同浓度砷对NMuMG毒性作用证明，砷是通过上调P21的mRNA表达，使细胞周期延长，进而抑制增殖，这可能是其导致乳腺癌的机制之一。

[1]BARDACH AE, CIAPPONI A, SOTO N, et al. Epidemiology of chronic disease related to arsenic in Argentina: A systematic review[J]. Sci Total Environ,2015(53):802-16.

[2]SMITH AH1, MARSHALL G1,YUAN Y, et al. Rapid reduction in breast cancer mortality with inorganic arsenic in drinking water[J]. EBioMedicine,2014,1(1):58-63.

[3]MOHAMMAD,GOLAM MOSTAFA, AND NICOLA CHERRY, et al. Arsenic in Drinking Water, Transition Cell Cancer and Chronic Cystitis in Rural Bangladesh[J]. Int J Environ Res Public Health,2015,12(11): 13739–13749.

[4]CARMEN GONZÁLEZ-HORTA, LOURDES BALLINAS CASARRUBIAS, BLANCA SÁNCHEZ-RAMÍREZ,et al. A Concurrent Exposure to Arsenic and Fluoride from Drinking Water in Chihuahua, Mexico[J], Int. J. Environ. Res. Public Health , 2015, 12(5):4587-4601.

[5]张明明,李婷,郑春雨,等.地砷病区乳腺癌致病机制研究[J].中国实验诊断学, 2017, 21(6):1064-1066.

[6] 岳立达,姜红如,臧照芳,等.环境与健康危险因素探讨[J].中国公共卫生管理, 2017, 33(1):53-59.

[7] 刘圆方,樊宏伟,高改云,等.地方性砷中毒与肝肾功能损伤关系研究[J]. 中国地方病防治杂志, 2016, 31(10):1127.

[8]杨哲, 朱勇,赵瑞.靶向P21基因saRNA抑制肝癌细胞生长实验研究[J]. 中华实用诊断与治疗杂志, 2015,29(2):132-135.

[9]满枋霖,赵良智,孙新. P21活化激酶在肿瘤中的作用[J].中国生物化学与分子生物学报, 2015, 31(6):579-585.

[10]周飞, 滕林,杨伟,等.缺氧诱导P21表达上调抑制大鼠胚胎H9C2心肌细胞增殖[J]. 临床心血管病杂志, 2017,33(7):694-698.

[11]胡振琪,梁宇生,巩玉玲,等.2016年土地科学研究重点进展评述及2017年展望——土地工程与技术分析报告[J].中国土地科学, 2017, 31(3):70-79.

[12] 齐鹏,余树全,张超,等.城市地表水表层沉积物重金属污染特征与潜在生态风险评估:以永康市为例[J]. 环境科学, 2015, 36(12):4486-4493.

[13]赵新华,沈雁峰,孙殿军,等. 中国饮水型砷中毒重病区病情调查报告[J].中国地方病学杂志, 2005, 24 (6):639.

[14]李向荣,林星余,肖忠秀,等. P21结构功能与研究新进展[J]. 医学综述, 2008, 14(14):2094-2097.

[15]王明芳,张文剑,王新红,等.三氧化二砷对人子宫内膜癌细胞裸鼠模型中Caspase-3表达的影响[J]. 实用癌症杂志, 2017, 32(1):9-11.

[16]SUZUKI S. Effects of inorganic arsenic on the rat and mouse urinary bladder[J]. Toxicol Sci, 2008, 106(2):350-363.

Study on the mechanism of sodium arsenite induced breast cancer in mice

DONG Xue, CAO Yang , LI Ting, MIAO Chenxi, YAN Qi*
(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Objective To study the effect of sodium arsenite (NaAsO2) on mouse mammary epithelial cells(NMuMG), and to provide a theoretical basis for arsenic induced breast cancer mechanism. Methods The effect of sodium arsenite on the morphology of mammary epithelial cells was studied by using mouse mammary epithelial cells as models. The effect of sodium arsenite on the apoptosis of mouse mammary epithelial cells was detected by fl ow cytometry. Cell cycle gene P21 mRNAs expression level was detected by real-time quantitative RT-PCR. Results NaAsO2has toxic effect on NMuMG. In a certain range of concentration, with the increase of NaAsO2concentration,the cell morphology changes obviously, and the apoptosis increases obviously, and dose-response relationship exists.The level of P21 mRNA, an inhibitor of cell proliferation, was increased by 18.12 times. Conclusion Sodium arsenite may inhibit the proliferation of NMuMG by up-regulating the expression of P21 gene, which may be one of the mechanisms of arsenic poisoning caused by breast cancer.

arsenic; proliferation; P21 gene; breast cancer

R914.5

A

2095-6258(2017)06-0880-03

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.007

吉林省教育厅项目（20163）。

董 雪（1978 -）,女,博士,副教授,主要从事老年病学及地方病学的研究。

*通信作者：阎 琪,女,教授,电话 - 18604309698,电子信箱 - 173424614@qq.com

2017-03-02）