不同孵化温度对中华鳖新生幼体免疫能力的影响

吴 琼，戚琴芹，耿 军，沈钱能，余佳倩，陆洪良，党 伟*

(1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036; 2.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018)

不同孵化温度对中华鳖新生幼体免疫能力的影响

吴 琼1*，戚琴芹1，2*，耿 军1，沈钱能1，余佳倩1，陆洪良1，党 伟1**

(1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036; 2.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018)

本研究选取中华鳖作为研究对象，在恒定温度28 ℃和波动温度(28±2) ℃条件下孵化中华鳖卵，对新生幼体的免疫能力和免疫指标进行了检测.结果表明，波动温度孵化条件下的新生中华鳖幼体对细菌的抵抗能力更强；但通过注射植物血球凝集素来刺激幼体的免疫反应，两组之间的差异并不显著.

孵化温度；中华鳖；新生幼体；免疫能力；植物凝集素

爬行动物作为变温动物，其体温的维持依赖于外界温度，因此其生命活动很大程度上受到外界温度的影响[1-2].对于卵生爬行动物来说，孵化的过程是爬行动物生命的初始阶段，孵化温度会影响爬行动物行为体型、生长速率、生活环境的选择以及行为能力[3].爬行动物的性别也不同于哺乳动物和鸟类保守的基因决定，而受孵化温度或环境温度的影响比较大，爬行动物的性别决定处于温度决定型和基因决定型的过渡期[4].关于爬行动物孵化温度对免疫能力的影响报道较少.

中华鳖是国内重要的水产养殖经济动物，同时也是爬行动物的代表物种之一，中华鳖恒温孵化温度区间为24—34 ℃，28—30 ℃是较为合适的孵化温度[5].已有研究表明孵化温度对中华鳖性别没有影响[6].已有的关于中华鳖波动温度孵化，多集中在幼体形态和运动能力方面的研究[7]，本研究中设置一个恒温孵化温度28 ℃，一个波动孵化温度(28±2) ℃，排除温度对性别影响的因素，研究重点侧重于温度孵化对中华鳖幼体免疫能力的影响.

使用致病菌攻毒和植物血球凝集素刺激两种方式对新生幼体免疫能力进行检测.植物血球凝集素(phytohemagglutinin, PHA)是一种从菜豆(Phaseolusvulgaris)中分离获得的促细胞分裂素，是植物凝集素的一种.植物凝集素可以诱导动物体内多种细胞类型包括T细胞在内的炎症反应，因此在脊椎动物中，使用植物凝集素皮下注射，根据皮肤的肿胀程度来反映免疫反应的强弱，肿胀程度越高表明免疫反应越强烈[8-10].

1 材料与方法

1.1 中华鳖卵的孵化和新生幼体体重的测定

2015年5月从杭州市余杭区上升农业开发有限公司购得中华鳖受精卵480枚，分为两组，每组240只，称重后置于铺有潮湿的蛭石的孵化盒中，每盒40只，分别放置在温度设置为28 ℃和(28±2) ℃ (24 h内，最高孵化温度为26 ℃，最低孵化温度为30 ℃，温度曲线呈正弦曲线状)的孵化箱中进行孵化，每3日补充基质散失的水分以保持基质湿度恒定.在孵化后期，每天检查孵化箱情况，将孵出幼体单个分开培养在28 ℃的温室中，待幼体剩余卵黄完全吸收后进行后续实验操作.

1.2 新生中华鳖幼体免疫能力的检测

使用本实验室分离获得的中华鳖致病菌嗜水气单胞菌对两个不同温度处理的新生幼体进行攻毒检测，计算获得该致病菌的半致死剂量(LD50).注射细菌浓度梯度为5 × 103CFU， 5 × 104CFU， 5 × 105CFU和5 × 106CFU，每组注射20只.

1.3 新生中华鳖幼体对植物血球凝集素的免疫反应

选取7只和10只新生中华鳖于28 ℃和(28±2) ℃温度孵化，然后分别用植物血球凝集素注射. 浓度为2.5 mg/ml的植物血球凝集素(phytohemagglutinin, PHA)20 μl分别注射新生幼体前肢的蹼和后肢的肌肉.其中左侧肢为对照侧，注射20 μl磷酸缓冲液(PBS)；右侧肢为实验侧，注射PHA.使用游标卡尺(Mitutuyo, 准确度: 0.01 mm)测量时间分别为注射前，注射后1h、3h和5h.使用公式(免疫强度=(肢体注射PHA后厚度-肢体注射PHA前厚度)-(肢体注射PBS后厚度-肢体注射PBS前厚度))计算反映新生幼体的免疫强度，前后肢分别计算.

1.4 数据分析

使用统计学软件SPSS 13.0分析致病菌的半致死剂量(LD50).使用统计学软件Statistica 6.0进行统计分析.对数据进行参数统计分析前，分别检验其正态性(Kolmogorov-Smirnov检验)和方差同质性(Bartlett检验).使用多因子方差分析检测孵化温度对中华鳖幼体体重的影响.使用单因子方差分析检测植物凝集素注射对肌肉肿胀度的影响，Tukey多重比较检验多样本处理间的差异.描述性统计值用平均值标准误表示，显著性水平设置为α= 0.05.

2 结果

28 ℃和(28±2) ℃入孵的中华鳖卵平均重量分别为(3.98 ± 0.03) g和(4.06 ± 0.04) g，新生幼体的初生体重分别为(2.79 ± 0.03 )g和(2.92 ± 0.03) g，统计学结果显示28 ℃孵化的新生中华鳖幼体体重显著低于(28±2 )℃孵化的新生中华鳖幼体体重(ANCOVA; F1, 353= 11.13,Plt; 0.001).

使用统计学软件SPSS 13.0中的Probit模块，根据不同浓度梯度细菌注射后中华鳖初生幼体累积死亡个体数计算获得不同温度孵化组28 ℃和(28±2) ℃的致病菌LD50分别是1.15 × 105CFU和 3.25 × 105CFU.

分析注射植物凝集素后免疫强度数据显示，温度孵化组28 ℃和28±2℃不同时间点前肢免疫强度无显著差异(F2, 18= 0.38791,P= 0.68401；F2, 27= 0.59758,P= 0.55726)，后肢也没有显著差异(F2, 18= 0.31764,P= 0.73186).注射后不同时间点不同温度孵化组之间前后肢免疫强度也无显著差异(如图1和图2所示).

图1 中华鳖幼体注射植物血球凝集素后前肢肿胀程度Fig. 1 The swelling height of Chinese soft-shelled turtle foreleg after PHA injection

图2 中华鳖幼体注射植物血球凝集素后后肢肿胀程度Fig. 2 The swelling height of Chinese soft-shelled turtle hindlimb after PHA injection

3 讨论

从获得的半致死量的数据来看，(28 ± 2) ℃孵化温度条件下孵出的幼体抵抗病菌的能力强于28 ℃恒温孵化的幼体，从而说明其免疫能力较强.本课题组以前的研究结果表明，低于28 ℃恒温孵化的幼体抗菌能力高，而高于28 ℃恒温孵化的幼体抗菌能力弱[11]，本研究中设置的波动孵化温度(28±2) ℃并未因为最高孵化温度高于28 ℃而出现抗菌能力变弱的现象.波动孵化温度影响新生幼体免疫能力的通路可能不同于恒温孵化温度.

注射植物凝集素在爬行动物中较多应用，在蜥蜴中通过测量计算注射植物凝集素后12 h肌肉的肿胀程度来反映其免疫能力的强弱[9-10].然而，在中华鳖中，本课题组在其他的实验中发现注射12 h后肌肉肿胀完全消失.因此，在本实验中设置更早时间点对肌肉肿胀程度的测定，结果分析表明，无论是组间还是组内不同时点，植物凝集素对中华鳖肌肉的肿胀度并没有显著差异.说明注射植物凝集素的结果作为一项免疫指标并不适合中华鳖来反映其免疫能力的强弱.

目前对于爬行动物的研究多集中在生态学和行为学的研究，本研究的目的在于借鉴其他物种研究手段更全面的理解爬行动物在适应环境过程中环境温度对免疫能力的影响.动物体对细菌的抵抗力是一个综合的免疫反应过程，本课题组在后续实验中会更深入进行反应通路的研究.中华鳖作为爬行动物的代表物种之一，有其特殊的优势，研究对象较其他野生爬行动物而言更易获得，对其进行深入的研究，成熟的结果可以直接应用于其它爬行动物，也能够在研究过程中，减少对野生爬行动物的影响.

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TheEffectsofDifferentIncubationTemperaturesontheImmunocompetenceofChineseSoft-shelledturtle(Pelodiscussinensis)'Hatchlings

WU Qiong1, QI Qinqin1,2, GENG Jun1, SHEN Qianneng1, YU Jiaqian1, LU Hongliang1, DANG Wei1

(1.College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China; 2.School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China)

In this study, the eggs of Chinese soft-shelled turtle were incubated in two different temperatures, the constant temperature 28 ℃and the fluctuation temperature (28±2) ℃. The immunocompetences of the hacthlings from these two incubation temperature were examed. The results showed that hatchlings from the fluctuation temperature were more resistant to pathogen challenges. But the immune responses after phytohemagglutinin showed no significant difference between the two groups.

incubation temperature; Chinese soft-shelled turtle; newborn larvae; immunocompetence; phytohemagglutinin

2017-03-23

* 两位作者对本论文贡献一致

浙江省自然科学基金面上项目(LY15C030006)；杭州市农业科研攻关专项(20150432B04)；浙江省大学生科技创新活动计划项目.

党伟(1984—)，女，助理研究员，博士，主要从事爬行动物生态学研究. E-mail：dang.wei@hotmail.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.05.011

Q948

A

1674-232X(2017)05-0514-04