液相色谱串联质谱法测定辐照鱼酱中多种氨基酸及同分异构体

邵宏宏，相兴伟，王琦，周向阳，周秀锦，沈飚，傅谧妮

(1.舟山出入境检验检疫局，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋开发研究院，浙江 舟山 316000)

液相色谱串联质谱法测定辐照鱼酱中多种氨基酸及同分异构体

邵宏宏1*，相兴伟2，王琦1，周向阳1，周秀锦1，沈飚1，傅谧妮1

(1.舟山出入境检验检疫局，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋开发研究院，浙江 舟山 316000)

建立了液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定鱼酱中辐照相关的多种氨基酸及同分异构体的分析方法，并建立了辐照鱼酱检测方法。样品通过盐酸水解，采用Waters Sunfire C18柱，0.1%甲酸溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱，正离子(ESI+)模式可快速有效分离及准确测定辐照鱼酱中的对酪氨酸(p-Tyrosine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)及其辐照特异性产物间酪氨酸(m-Tyrosine)和邻酪氨酸(o-Tyrosine)的含量。在10～500 μg/L范围内，所测氨基酸及同分异构体的线性相关系数为0.9985～0.9998，回收率为75.1%～104.5%，相对标准偏差小于8.9%。方法适用于对含蛋白质鱼酱中辐照相关的多种氨基酸和其同分异构体的测定，从而对其是否经过辐照进行准确鉴定。

辐照；鱼酱；氨基酸；同分异构体；液相色谱串联质谱

1 概述

食品辐照可有效控制食品中食源性病原体，减少微生物负载和虫害，抑制生理过程和延长货架期，被广泛应用于食品加工和贮存领域[1]。香辛料调味品是应用辐照技术较早且应用最为广泛的领域之一，目前，中国是亚洲最大的辐照食品生产国[2]。

辐照对食品的品质和安全性的影响还尚未定论，不当的辐照会对食品的感官、营养成分造成一定的影响[3-12]。目前，美国、欧盟等地区对食品辐照有比较详细的要求，对于食品种类、辐照剂量、辐照设施、食品辐照的标示都有明确的规定。欧盟有关食品辐照的框架指令1999/2/EC和执行指令1999/3/EC分别规定，所有经辐照的食品或含有辐照食品成分的必须在食品标签上标明，且允许辐照处理的食品中不包括水产品。

深海鱼酱是对海洋低值鱼类的加工和综合利用后的一种新型的食品，其富含蛋白质，具有较高的营养价值。由于辐照无二次污染和化学残留，并对渔药、农药及水产品常用的保鲜剂具有一定的抑制和降解作用，近年来辐照技术被广泛应用于水产品及其制品的加工、运输及储存过程中的杀菌保鲜，从而延长货架期。鱼酱制品及其生产的原料来源有可能经过辐照处理。

近年来，我国出台了多个辐照食品的检测标准，受方法本身采用的原理所限，每种方法均适用于特定类型的样品[13-22]。热释光分析法(TL)是辐照水产品和香辛料调味品检测的常用方法，欧盟EN 1788法规中对辐照水产品检测也采用了该法[23]。鱼酱在其加工过程中经过了去内脏、脱腥处理、蒸煮，尤其是多次漂洗，实际检测过程中很难提取到足够量的矿物质用于热释光分析法检测，目前对该类产品的检测还存在一定的难度。食品经辐照后，产生的羟基自由基会进攻含芳环的苯丙氨酸的邻、间、对位，进而生成酪氨酸3种异构体——对酪氨酸(p-Tyrosine)、邻酪氨酸(o-Tyrosine)和间酪氨酸(m-Tyrosine)[24,25]。除对酪氨酸外，邻酪氨酸(o-Tyrosine)和间酪氨酸(m-Tyrosine)本身在基体中不存在。本文基于HPLC-MS/MS技术，通过测定苯丙氨酸、酪氨酸及辐照特异性产物o-Tyrosine和m-Tyrosine的含量建立辐照鱼酱的检测方法。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

样品：鱼酱由舟山市水产加工企业提供，其原料来源为各类深海低值鱼类，-20 ℃保存备用。

氨基酸标准品：DL-Tyrosine (CAS：556-03-6，纯度≥99.0%)、间酪氨酸(CAS：775-06-4，纯度≥99.0%)、邻酪氨酸 (CAS：2370-61-8，纯度≥98.0%)、丙苯氨酸(CAS：150-30-1，纯度≥99.0%)均为美国Sigma-Aldrich公司产品；分别准确称取一定量标准品，用少量水溶解，加水定容至100 mL。使用时用超纯水将上述标准品逐级稀释成不同浓度的混合标准溶液，上机前以0.22 μm微孔滤膜过滤。

试剂：丙酮、甲醇均为色谱纯，德国默克公司；去离子水(电阻率18.2 MΩ·cm)，经0.22 μm微孔滤膜过滤后使用；甲酸，Riedel deHaen公司；盐酸。

API3000高效液相色谱串联质谱仪：美国AB Sciex公司，配有溶剂脱气装置、自动进样器；天平(感量0.0001 g)；超声波清洗器：德国Elma公司；MSI漩涡振荡器：德国IKA公司；3-18K低温高速离心机：美国Sigma公司；恒温干燥箱：美国Thermo Fisher公司；0.22 μm尼龙滤膜过滤头。

2.2 方法

2.2.1 样品前处理

将待测的鱼酱充分混匀，搅碎后装入容器内，密封、冷藏(-18 ℃)备用；准确称取0.5 g (精确至0.01 g)，经前处理后的样品于20 mL酸解玻璃管中，加入10 mL 6 mol/L盐酸，充氮气后盖紧旋盖，于110 ℃下酸解过夜。取酸解液用滤纸过滤后，置于玻璃离心管中，4 ℃，12000 r/min离心10 min。取上清液5 mL，35 ℃，N2吹干，剩余的液体用冷冻冻干机冻干。用1 mL 0.1%(V/V)甲酸水溶液溶解，用0.22 μm水相尼龙滤膜过滤。取10 μL滤液用 0.1%(V/V)甲酸水溶液定容至1 mL，即稀释100倍，2个浓度的样品均用HPLC-MS/MS法测定对酪氨酸和苯丙氨酸。

2.2.2 色谱及质谱条件

2.2.2.1 色谱分离条件

采用Waters Sunfire C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流速0.2 mL/min；流动相A：0.1%(V/V)甲酸水溶液，流动相B：甲醇；进样量：20 μL；柱温：35 ℃；色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

2.2.2.2 质谱条件

离子源Turbo V，电离模式ESI+，采集方式MRM模式，离子化温度(TEM)500 ℃；喷雾电压5000 V，雾化气(GS1)55 psi，辅助气(GS2)60 psi，气帘气(CUR)10 psi，碰撞气(CAD)为 High；入口电压(EP)12 V，碰撞室出口电压(CXP)10 V。各化合物的具体采集参数见表2。

表2 优化的质谱条件参数Table 2 Optimized parameters of mass spectrum conditions

2.2.3 测定方法

将标准储备液逐级稀释成浓度为10，20，50，100，500 μg/L的氨基酸及同分异构体的混合标准溶液，按上述条件测定；分别取未经任何加工和辐照的待测样品及经1,7 kGy辐照后的样品，与待测样品一起进行前处理和上机测定。

3 结果与分析

3.1 样品提取方式的选择

对2种提取方式进行了考察。对样品分别进行1，2，5，7，10，20 kGy剂量的辐照。将上述样品分A，B 2组，分别以不同方式进行提取和前处理，并将结果进行比对。A组样品加入0.1%(V/V)甲酸水溶液直接提取，均质后室温下超声振荡提取30 min，4 ℃温度下12000 r/min离心后取上清液，加入丙酮于-18 ℃下沉淀蛋白质，4 ℃温度下高速离心后取上清液N2吹干。B组样品置于20 mL酸解玻璃管中，加入10 mL 6 mol/L盐酸，充氮气后盖紧旋盖，于110 ℃下酸解过夜。取酸解液用滤纸过滤后，置于玻璃离心管中，4 ℃，12000 r/min离心后取上清液35 ℃下N2吹干，剩余的液体用冷冻冻干机冻干。样品吹干后均用1 mL 0.1%甲酸水溶液(V/V)溶解，用0.22 μm水相尼龙滤膜过滤。

上机测定后结果显示：A，B 2组中未经辐照的样品中含高浓度的对酪氨酸和苯丙氨酸，未发现邻酪氨酸和间酪氨酸。A组中经1,2 kGy低剂量辐照的样品，未能检测到辐照特异性产物邻酪氨酸和间酪氨酸，而大于5 kGy辐照后的样品则能检测到邻酪氨酸和间酪氨酸。B组样品采用盐酸高温消解，经不同剂量辐照的样品中均能检测到一定量的邻酪氨酸和间酪氨酸。因此采用1%的甲酸直接超声提取，在低剂量辐照的样品中无法提取到足够量的辐照特异性产物邻酪氨酸和间酪氨酸用于辐照检测。采用盐酸水解的前处理方式比0.1%的甲酸直接超声提取具有更好的提取效率，因此选择高温酸水解进行氨基酸提取。

3.2 高温水解对辐照特异性产物的影响

含蛋白质食品中的苯丙氨酸经辐照后可产生邻酪氨酸和间酪氨酸，本文通过测定水产品中是否含这2种同分异构体确定样品是否经过辐照，为确定这2种同分异构体是辐照水产品的特征性产物，前处理中长时间的高温水解不会导致样品中产生邻酪氨酸和间酪氨酸，对110 ℃条件下4,8,12,24 h水解后未经辐照样品中的氨基酸进行了测定，结果显示样品中均未检测到邻酪氨酸和间酪氨酸。因此高温下长时间的水解不会导致样品产生邻酪氨酸和间酪氨酸，对这2种氨基酸作为判断样品是否经过辐照的特征性产物不会产生影响。

3.3 样品水解时间的优化

水产品中氨基酸的测定通常采用110 ℃下进行水解，因辐照后产生的酪氨酸异构体含量较少，为保证其完全水解并提高检测效率，分别考察了不同水解时间对氨基酸回收率的影响，确定110 ℃下最佳水解时间。结果显示(见表3)：样品经8 h以上水解后，各种氨基酸含量从最初的快速增长逐渐趋于稳定，在12～24 h水解后，各含量达到最高值，在保证水解效率前提下为尽量减少前处理时间，缩短检测周期，水解时间选择12 h为最佳。

表3 110 ℃不同水解时间对含量(mg/kg)的影响Table 3 Effect of different hydrolysis time on concentrate of amino acid (mg/kg) at 110 ℃

注：ND为未检出。

进一步考察了高温水解时间对各氨基酸回收率的影响。取未经辐照的样品，加入m-Tyrosine和o-Tyrosine的标准溶液使其浓度分别为1000,5000 μg/kg，由于水产品中自身所含苯丙氨酸和对酪氨酸含量较高，因此加标浓度较高。110 ℃水解不同时间进行提取，上机测定前取前处理后未添加的空白样液加入同样浓度的各氨基酸标准溶液，同时上机测定。通过与前处理后的样品添加浓度比较计算回收率，12 h水解后各氨基酸均达到实验要求(见表4)，目标物无明显损失。因此选择高温酸水解12 h进行前处理为最佳。

表4 110 ℃不同水解时间对回收率(%)的影响Table 4 Effect of different hydrolysis time on recovery rate (%) at 110 ℃

3.4 色谱条件的优化

3.4.1 色谱柱的选择

由于对酪氨酸在水产品中大量存在，其与因辐照后产生的邻酪氨酸和间酪氨酸为同分异构体，分子量相同，会产生相同的MRM离子对，因此无法只通过MRM离子对进行定性和定量，需结合各个氨基酸的出峰时间进行准确检测。并且3种同分异构体出峰时间相近，需要通过液相部分进行有效的分离，色谱柱的选择尤为重要。考察了不同填料及不同规格的色谱柱对酪氨酸同分异构体及苯丙氨酸的分离效果， Waters Sunfire C18色谱柱能将4种氨基酸有效分离，且峰形较好，并结合流动相的梯度洗脱程序，其余的色谱柱分离效果不佳，无法达到实验要求。

图1 p-Tyrosine，Phenylalanine及辐照特异性产物m-Tyrosine 和o-Tyrosine MRM总离子流图Fig.1 MRM total ion current of p-Tyrosine, Phenylalanine and irradiation-specific products m-Tyrosine and o-Tyrosine

注：1为对酪氨酸；2为间酪氨酸；3为邻酪氨酸；4为苯丙氨酸。

3.4.2 质谱条件的优化

在ESI+电离模式下，进行一级质谱扫描，然后对母离子做子离子全扫描。作为同分异构体，p-Tyrosine、m-Tyrosine和o-Tyrosine会产生相同的离子碎片，但不同氨基酸产生的相同离子碎片的丰度不同。根据得到的碎片离子信息，选择丰度较高的2个特征碎片离子作为该氨基酸定量离子(见表2)。并结合色谱有效的分离，对酪氨酸的3种同分异构体进行准确的定性和定量。

3.5 线性范围、精密度和检出限

3.5.1 线性范围与检出限

将氨基酸标准溶液用0.1%甲酸溶液稀释配制成不同浓度的混合标准溶液，以浓度(x，mg/L)为横坐标，在对应保留时间下的定量离子对应峰面积(y)为纵坐标，进行线性回归。定量离子10～500 μg/L，待测氨基酸线性关系良好(见表5)。以样品空白信噪比(S/N)的10倍计算方法的定量限为20 μg/kg，以3倍信噪比(S/N)计算检出限为6 μg/L，能满足食品安全的检测需要。

表5 4种氨基酸的回归方程及相关系数Table 5 Regression equation and correlation coefficient of four kinds of amino acids

3.5.2 回收率与精密度

精密称取2种来源于不同生产企业的样品0.5 g，定量加入标准品，使各氨基酸浓度添加量相当于50,100,200 μg/kg，每个水平重复测定6次，测定加标回收率。结果表明回收率在75.1%～104.5%，相对标准偏差小于8.9%(见表6)。

表6 待测氨基酸的平均回收率与相对标准偏差(n=6)Table 6 The average recoveries and relative standard deviation of amino acids to be tested (n=6)

3.6 实际样品测定

分别从国内市场上及水产加工企业抽取样品，测定时取未经辐照及经7 kGy辐照后的鱼酱制品，与待测样品同时进行前处理，处理后的样液用HPLC-MS/MS条件分析。未经辐照样品中未发现o-Tyrosine和m-Tyrosine，但含有较高含量的苯丙氨酸和对酪氨酸，见图2。经7 kGy辐照后的鱼酱中含有m-Tyrosine和o-Tyrosine(见图3)。经样品测定结果显示：结合离子对及不同酪氨酸的出峰时间进行判断，只在一份样品中发现有m-Tyrosine和o-Tyrosine，可判定这类样品经过了辐照处理。这可能与熟食较高微生物卫生控制要求有关，利用辐照可有效杀灭并控制微生物尤其致病菌的生长，且国内目前允许较低剂量的辐照。

图2 未辐照样品MRM图Fig.2 MRM chromatogram of non-irradiated sample

注：1为p-Tyrosine；2为Phenylalanine。

图3 经辐照后样品MRM图Fig.3 MRM chromatogram of irradiated sample

注：1为p-Tyrosine；2为m-Tyrosine；3为o-Tyrosine；4为Phenylalanine。

4 结论

针对鱼酱制品采用了酸高温水解的提取方式，可达到对待测物质的有效提取。采用了HPLC-MS/MS方法对辐照样品进行检测，可在30 min内完成对辐照相关多种氨基酸及其同分异构体的分离和定量检测，解决了氨基酸同分异构体难分离、难测定的问题，为鱼酱的营养成分分析提供了依据，并在此基础上建立了判断鱼酱制品是否经过辐照的有效方法。该方法定性分析结果可靠、检测限低，不需要二次辐照，解决了辐照海产调味品检测无方法可依的问题，尤其是无法提取硅酸盐用于热释光检测的样品的辐照检测问题，适用于辐照海产调味品的快速检测。

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DeterminationofAminoAcidsandIsomersinIrradiatedFishPastebyHPLC-MS/MS

SHAO Hong-hong1*, XIANG Xing-wei2, WANG Qi1, ZHOU Xiang-yang1, ZHOU Xiu-jin1, SHEN Biao1, FU Mi-ni1

(1.Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan 316100, China； 2.Zhejiang Marine Development Research Institute, Zhoushan 316000, China)

A credible HPLC-MS/MS method for determination of isomers of Tyrosine and Phenylalanine is established to identify the irradiated fish paste. The sample is dissolved with hydrochloric acid. The separation is achieved on Waters Sunfire C18column by mobile phase of methanol and 0.1% formic acid for gradient elution. The positive ion (ESI+) mode can be used for rapid and effective separation and accurate determination of the content ofp-Tyrosine, Phenylalanine andm-Tyrosine ando-Tyrosine in the irradiated specific products. In the range of 10～500 μg/L, the linear correlation coefficient of the measured amino acids and isomers is 0.9985～0.9998, the relative standard deviation is less than 8.9%.The method is suitable for the determination of a variety of amino acids and their isomers related to irradiation in protein-containing fish paste, so as to accurately identify whether they are irradiated.

irradiation；fish paste；amino acid；isomers；HPLC-MS/MS

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.032

1000-9973(2017)12-0141-06

2017-07-15 *通讯作者

浙江省自然科学基金项目(LQ15c200005)；浙江省公益技术研究农业项目(2015C32101)；浙江省科技计划项目(2016C37041)

邵宏宏(1981-)，女，工程师，硕士，研究方向：色谱分离分析。