红曲固态发酵产Monacolin K工艺条件的优化

张安，常聪，孟霞，范娟，张文学

(四川大学 轻纺与食品学院，成都 610065)

红曲固态发酵产Monacolin K工艺条件的优化

张安，常聪，孟霞，范娟，张文学*

(四川大学 轻纺与食品学院，成都 610065)

采用响应面优化法对红曲产Monacolin K的固态发酵条件进行了优化，结果表明：最佳发酵条件为氮源(玉米粉)1%、碳源(淀粉)4%、初始pH 5.0、培养温度28 ℃、装米量31.77 g/250 mL三角瓶、初始含水量40.72%、接种量11.14% (V/V)，该设计中模型预测的Monacolin K最大值为0.256%，进行重复验证实验，得到Monacolin K实测值为0.258%，与模型预测值接近。此结果可为大规模生产功能性红曲提供一定的理论基础。

红曲；Monacolin K；固态发酵条件；响应面法

红曲是以大米为基质，接种红曲霉发酵而得的一种深红色物质[1]。红曲可以用于酿酒、制醋，也可作为糕点等食品的着色剂和调味剂，还可作为中药使用[2]。研究表明[3]：红曲的次级代谢产物Monacolin K可强有力地抑制胆固醇的合成，是安全、高效、低毒的降血脂物质，其市场需求量很大[4,5]。但是Monacolin K却因其产量较低、红曲产品质量不稳定等缺点，不适合于工业化大规模生产，因此通过发酵条件优化，提高红曲的Monacolin K产量，是当前解决功能红曲问题的重要途径[6]。熊晓辉等[7]确定了大米培养基中添加附加碳源、氮源、无机盐的种类以及添加量。刘爱英等[8]研究称，选取碳水化合物及蛋白质含量高、碳氮比较低的大米进行红曲固态发酵，其产物的Monacolin K含量较高。Chiu等[9]将红曲霉接种于旋转式带有5 cm孔径发酵床设备中，固态发酵生产红曲米，达到了节约成本、缩短发酵时间、简化发酵工艺的目的。本文首先进行一系列的单因素实验，确定红曲固态发酵各影响因素的大致范围，接着采用Plackett-Burman设计法筛选出显著性较高的主要影响因子，最后通过Box-Behnken实验设计进行非线性拟合，得到拟合方程并绘制出响应图，得出红曲固态发酵的最佳条件，以期进一步提高其发酵产Monacolin K水平，从而为车间工业化生产红曲提供前期理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌种

紫色红曲霉QH24(Monascuspurpureus)，本实验室保存。

1.1.2 培养基

种子液培养基：马铃薯20%，无水葡萄糖2%，自然pH，121 ℃灭菌20 min。

固态发酵培养基：清洗后的大米浸泡1 h，沥干水分，蒸煮至米粒分散、微粘、无白心状态。蒸煮后的大米分别取30 g分装于250 mL三角瓶中，121 ℃，0.1 MPa灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂

色谱纯：甲醇、磷酸；分析纯：甲醇、无水葡萄糖、琼脂粉、冰乙酸、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏；市售：大豆粉、玉米粉。

1.1.4 主要仪器设备

单人双面净化工作台、立式压力蒸汽灭菌锅、台式高速冷冻离心机、高效液相色谱仪、电热恒温真空干燥箱、恒温振荡培养箱、电子天平、pH计、超声清洗机、可调万用电炉、电磁炉、蒸锅、40目筛等。

1.2 实验方法

1.2.1 红曲米制作方法

种子液：将红曲霉斜面孢子刮下置于三角瓶中，振荡充分，无菌脱脂棉过滤孢子液，将孢子稀释至浓度约为 106～107个/mL，以2%的接种量接种于培养基中，120 r/min，28 ℃摇床振荡培养48 h。

红曲米：将种子液按照10%(V/V)接种量接种于装有30 g大米基础培养基的250 mL三角瓶中，并用无菌玻璃棒打散，于28 ℃培养15天。

1.2.2 红曲中Monacolin K的检测方法[10，11]

将红曲发酵产物于40 ℃下烘干研磨至40目，称取0.5 g于50 mL容量瓶中，加入适量无水甲醇，室温下超声1 h，中间间歇振荡3～4次最终定容到50 mL。以4000 r/min的转速离心10 min。取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液取20 μL经HPLC检测，并根据HPLC标准曲线计算内酯式及酸式Monacolin K含量，并计算Monacolin K总含量。HPLC检测方法参考QB/T 2847-2007。

1.2.3 单因素实验

进行一系列单因素实验，对附加碳源种类及其添加量、附加氮源种类及其添加量、初始含水量、初始pH、接种量、装米量、培养温度7个会对红曲霉生长状况产生影响的发酵条件进行实验，分析其对红曲霉菌Monacolin K产率的影响。

1.2.4 Plackett-Burman实验

用Plackett-Burman法筛选出单因素实验中对红曲霉固态发酵的影响最为显著的因素。

1.2.5 Box-Behnken实验

根据Plackett-Burman实验得出的显著性因素，设计Box-Behnken实验，并对最终红曲固态发酵的最佳发酵条件进行验证。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 附加碳源种类及添加量对Monacolin K产量的影响

在固态发酵培养基中，分别添加5%的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、甘油作为附加碳源，进行红曲固态发酵，并将不添加任何附加碳源进行固态发酵的红曲米作为空白对照，实验结果见图1中a。当以淀粉为单独的附加碳源时，Monacolin K的产量最高，达到0.225%，选择影响最大的淀粉作为红曲固态发酵的碳源。在固态发酵培养基中，分别添加2%，4%，6%，8%，10%的淀粉为附加碳源，进行红曲固态发酵，并将不添加任何附加碳源进行固态发酵的红曲米作为空白对照，实验结果见图1中b。当淀粉添加量为4%时，Monacolin K含量最高，达到0.227%。选择4%作为碳源添加量。

图1 不同附加碳源及添加量对Monacolin K产量的影响Fig.1 Effects of different types and different dosage of additional carbon source on the yield of Monacolin K

2.1.2 附加氮源种类及添加量对Monacolin K产量的影响

在固态发酵培养基中，分别添加2%的玉米粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、大豆粉作为附加氮源，进行红曲固态发酵，并将不添加任何附加氮源进行固态发酵的红曲米作为空白对照，实验结果见图2中a。当以玉米粉为单独的附加氮源时，Monacolin K的产量最高，达到0.215%。选择玉米粉作为红曲固态发酵的氮源。在固态发酵培养基中，分别添加1%，2%，3%，4%，5%的玉米粉为附加氮源，进行红曲固态发酵，并将不添加任何附加氮源进行固态发酵的红曲米作为空白对照，实验结果见图2中b。当玉米粉添加量为1%时，Monacolin K含量最高，达到0.218%。选择1%作为氮源添加量。

图2 不同附加氮源及添加量对Monacolin K产量的影响Fig.2 Effects of different types and different dosage of additional nitrogen source on the yield of Monacolin K

2.1.3 不同接种量对Monacolin K产量的影响

接种量分别为6%，8%，10%，12%，14%(V/V)，进行红曲固态发酵，并将不接种红曲霉菌的大米培养基作为空白对照，实验结果见图3。当接种量为10%(V/V)时，Monacolin K含量最高，达到0.196%。选择10%(V/V)作为红曲固态发酵的接种量。

图3 不同接种量对Monacolin K产量的影响Fig.3 Effects of different inoculum size on the yield of Monacolin K

2.1.4 不同初始含水量对Monacolin K产量的影响

按照40 ℃下烘干法测定固态发酵培养基初始含水量，控制固态发酵培养基初始含水量分别为20%，30%，40%，50%，60%，进行红曲固态发酵，并将生米灭菌接种红曲霉进行固态发酵作为空白对照，实验结果见图4。当初始含水量为40%时，Monacolin K含量最高，可达到0.199%。选择40%作为红曲固态发酵的初始含水量。

图4 不同初始含水量对Monacolin K产量的影响Fig.4 Effects of different initial water content on the yield of Monacolin K

2.1.5 不同初始pH对Monacolin K产量的影响

用乙酸溶液调节固态发酵培养基使其初始pH值分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，进行红曲固态发酵，并将自然pH的大米培养基(pH值7.2)接种进行固态发酵作为空白对照，实验结果见图5。当初始pH为5.0时，Monacolin K含量最高，达到0.228%。选择5.0作为红曲固态发酵的初始pH。

图5 不同初始pH对Monacolin K产量的影响Fig.5 Effects of different initial pH values on the yield of Monacolin K

2.1.6 不同培养温度对Monacolin K产量的影响

分别以26，28，30，32，34 ℃作为红曲固态发酵的培养温度，进行红曲固态发酵，并将室温条件(16 ℃左右)下固态发酵的红曲米作为空白对照，实验结果见图6。当培养温度为28 ℃时，Monacolin K含量最高，达到0.198%。选择28 ℃作为三角瓶红曲固态发酵的培养温度。

图6 不同培养温度对Monacolin K产量的影响Fig.6 Effects of different cultivation temperatures on the yield of Monacolin K

2.1.7 不同装米量对Monacolin K产量的影响

分别添加10，20，30，40，50 g的固态发酵培养基于250 mL三角瓶中，进行红曲固态发酵，实验结果见图7。当三角瓶中的装米量为30 g/250 mL时，Monacolin K含量最高，达到0.196%。选择30 g/250 mL作为红曲固态发酵的装米量。

图7 不同装米量对Monacolin K产量的影响Fig.7 Effects of different amount of rice on the yield of Monacolin K

综上所述，红曲固态发酵产Monacolin K的最佳单因素条件为：氮源(玉米粉)1%、碳源(淀粉)4%、初始pH 5.0、培养温度 28 ℃、装米量30 g/250 mL三角瓶、初始含水量40%、接种量10%(V/V)。

2.2 Plackett-Burman实验结果

2.2.1 Plackett-Burman实验设计

以上述7个因素作为实验因子，再设计4个空项方便误差分析，选择适宜的高低水平，使用Design-Expert分析软件进行PB实验设计，以Monacolin K总产量作为响应值，进行实验分析。Plackett-Burman实验的因素水平设计见表1。

表1 Plackett-Burman实验因素水平设计表Table 1 Plackett-Burman experimental factors and levels design table

2.2.2 Plackett-Burman实验结果与讨论

按照2.2.1设计的实验进行红曲固态发酵，并提取发酵产物中的Monacolin K，HPLC法进行测定，将测定结果填入表2。采用Design-Expert软件对Monacolin K产量进行数据回归分析，结果见表3。

表2 Plackett-Burman实验设计与结果Table 2 Plackett-Burman experimental design and results

其中模型Prob>F=0.0044，相关系数 R2=0.9759，可知该回归模型极显著(P<0.01)，其拟合程度及可信度很高，该设计较成功。

表3 Plackett-Burman实验结果分析Table 3 Plackett-Burman experimental results analysis

由表3可知，因素 X6(装米量)、X3(接种量)、X4(初始含水量)对Monacolin K产量的影响达到了显著水平(P<0.05)。

2.3 响应面设计实验结果

2.3.1 响应面实验设计

采用Design-Expert 软件，对初始含水量、接种量、装米量3个因素进行实验设计，Box-Behnken实验设计因素与水平表见表4。

表4 Box-Behnken实验因素水平设计表Table 4 Box-Behnken experimental factors and levels design table

2.3.2 响应面设计实验结果与分析

按照2.3.1的实验设计进行红曲固态发酵实验，将各实验组测定的Monacolin K产量填入表5。

表5 Box-Behnken实验设计与结果Table 5 Box-Behnken experimental design and results

运用Design-Expert分析软件对实验数据进行回归拟合处理，得到二次回归分析的一系列相关数据，见表6，得出目标值Y对A(装米量)、B(初始含水量)和C(接种量)3个显著性因素的二次多项式回归方程：

Y=+0.25+0.033A+0.014B+0.024C+0.017AB+0.031AC+0.011BC-0.061A2-0.077B2-0.081C2。

式中：Y 为Monacolin K产值(%)，A，B，C为考察因素的编码值。

表6 Box-Behnken实验结果分析Table 6 Box-Behnken experimental results analysis

对QH24红曲霉Monacolin K总产量的回归模型进行方差分析，回归模型极显著(P<0.0001)。回归模型的相关系数R2=0.9819，校正系数RAdj2=0.9586，说明该回归模型误差较小，且与实际实验结果拟合性很好，可以对红曲固态发酵条件进行分析及预测。通过显著性分析可知：回归模型的一次项均显著(P<0.05)，二次项均极显著(P<0.0001)，而交互项AC显著(P<0.05)，AB，BC不显著(P>0.05)。3个因素对红曲固态发酵产Monacolin K能力的影响强度顺序依次为装米量>接种量>初始含水量。利用Design-Expert做出二次回归方程的响应面及其等高线，见图8(a和b)、图9(a和b)、图10(a和b)。

图8 装米量(A)和初始含水量(B)对Monacolin K产量的影响Fig.8 The effects of amount of rice (A) and initial water content (B) on yield of Monacolin K

注：接种量为10%(V/V)。

由图8可知，当接种量为10%(V/V)时，装米量和初始含水量两个因素的相互影响不显著(P>0.05)。由图8中a可知，接种量不变时，随初始含水量及装米量的增加，Monacolin K的产量均呈现先增大后减少的趋势。由图8中b可知，装米量在28～35 g范围内，初始含水量在38%～44%范围内时，Monacolin K产量较高。

图9 装米量(A)和接种量(C)对Monacolin K产量的影响Fig.9 The effects of amount of rice (A) and inoculum size (C) on yield of Monacolin K

注：初始含水量为40%。

由图9可知，当初始含水量为40%时，装米量和接种量两个因素的相互影响显著(P<0.05)。由图9中a可知，初始含水量不变时，随接种量及装米量的升高，Monacolin K的产量均呈现先增加后减少的趋势。由图9中b可知，装米量在28～35 g范围内，接种量在8%～12%范围内时，Monacolin K产量较高。

图10 初始含水量(B)和接种量(C)对Monacolin K产量的影响Fig.10 The effects of initial water content (B) and inoculum size (C) on yield of Monacolin K

注：装米量为30 g。

由图10可知，当装米量为30 g时，接种量和初始含水量两个因素的相互影响不显著(P>0.05)。由图10中a可知，Monacolin K产量随接种量及初始含水量的升高先增加后减少。由图10中b可知，初始含水量在38%～44%范围之间，接种量在8%～12%范围内时，Monacolin K产量较高。

对二次回归方程求解，编码值：A=0.033，B=0.014，C=0.024。对其解码后可得3个因素的真实值，A=31.77，B=40.72，C=11.14，该真实值即为影响红曲中Monacolin K产量的3个显著性因素之间的最佳组合：装米量31.77 g、初始含水量40.72%、接种量11.14%(V/V)，该设计中模型预测的Monacolin K最大产量值为0.256%。

为验证该模型，采用模型中的最佳发酵条件：氮源(玉米粉)1%、碳源(淀粉)4%、初始pH 5.0、培养温度28 ℃、装米量31.77 g、初始含水量40.72%、接种量11.14%(V/V)，进行了重复验证实验，结果见表7。Monacolin K实测值为0.258%，与模型的预测值接近，说明该模型是准确有效的。

表7 重复实验Table 7 Repeatability experiment %

3 结论

本文首先进行一系列单因素实验，得出影响红曲固态发酵产Monacolin K的各因素最佳范围，接着采用Plackett-Burman实验筛选出显著性因素，以Monacolin K产量为响应值，设计Box-Behnken响应面实验，最终得到红曲固态发酵最佳条件：氮源(玉米粉)1%、碳源(淀粉)4%、初始pH 5.0、培养温度 28 ℃、装米量31.77 g、初始含水量40.72%、接种量11.14%(V/V)，按照以上条件进行重复验证实验，Monacolin K实测值为0.258%，与模型的预测值接近，说明该模型是准确有效的。本研究为大规模固态发酵红曲的工艺提供了理论基础。

[1]李东,谢静,王敏,等.红曲起源新考[J].中药材,2007,30(4):484-487.

[2]李东,刘源,谢静,等.红曲的起源、分类学及生药学鉴定[J].中国药业药学专论,2009,18(3):1-2.

[3]Endo A.Monacolin K,a new hypocholesterolemic agent that specifically inhibits 3-hydroxy-3-methylglu-taryl coenzyme a reductase[J].Antibitics,1980,33(3):334-336.

[4]Ratner S J,杨文凯译.高血脂症的治疗动向[J].国外医药-合成药、生化药、制剂分册,1996,13(5):259-263.

[5]涂志英,邵伟.国内外红曲的应用现状及发展趋势[J].中国酿造,2008(7):7-9.

[6]李永丽,雷恒,王红磊,等.HPLC法测定红曲诱变菌种中Monacolin K含量[J].食品工程,2010(5):125-128.

[7]熊晓辉,张李阳,韦策,等.红曲霉菌产Monacolin K固体发酵条件的优化[J].无锡轻工大学学报,2004(1):20-23.

[8]刘爱英,孙伟,梁宗琦,等.不同米质发酵生产红曲对莫纳可林K含量的影响[J].贵州农业科学,2003,31(5):5-7.

[9]Chiu C,K Ni,Y Guu,et al.Production of red mold rice using a modified Nagata type koji maker [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2006,73(2):297-304.

[10]朱效刚.红曲功能性成分分析及发酵法生产的研究[D].无锡:江南大学，2005.

[11]胡文效,魏彦锋,蒋锡龙,等.高产Monacolin K红曲霉菌种的诱变选育及液态发酵工艺优化[J].食品工业科技,2013,34(24):296-301.

OptimizationofSolid-stateFermentationConditionsforMonascusProducingMonacolinK

ZHANG An, CHANG Cong, MENG Xia, FAN Juan, ZHANG Wen-xue*

(College of Light Industry, Textile and Food Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

In order to explore the effects on metabolic capacity of Monacolin K, use the response surface method to optimize the solid-state fermentation conditions forMonascusstrains.The results show that the optimal fermentation conditions are obtained: nitrogen source (corn powder) 1%, carbon source (starch) 4%, initial pH of 5.0, cultivation temperature of 28 ℃, amount of rice of 31.77 g/250 mL triangular flask, initial moisture content of 40.72%, inoculum size of 11.14% (V/V). The maximum model prediction value of Monacolin K in the design is 0.256%, the repeated validation experiments are carried out with the best experimental conditions in the model, and the measured value of Monacolin K is close to the predicted value of 0.258%, which can provide a certain theoretical basis for large-scale production of functionalMonascus.

Monascus；Monacolin K；solid-state fermentation conditions；response surface method

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.008

1000-9973(2017)12-0038-06

2017-06-20 *通讯作者

四川省泸州市科技计划(2015CDLZ-S07)

张安(1993-)，女，硕士，研究方向：食品科学；

张文学(1963-)，男，教授，博士生导师，研究方向：发酵工程。