响应面法优化假单胞菌HFE733产脂肪酶发酵培养基的研究

胡珺，王常高，林建国，杜馨，蔡俊

(湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室 工业发酵湖北省协同创新中心，武汉 430068)

响应面法优化假单胞菌HFE733产脂肪酶发酵培养基的研究

胡珺，王常高，林建国，杜馨，蔡俊*

(湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室 工业发酵湖北省协同创新中心，武汉 430068)

研究采用响应面法对假单胞菌HFE733产脂肪酶的发酵培养基进行了优化。在前期运用单因素试验优化的基础上，利用Plackett-Burman试验设计筛选出培养基组分中影响脂肪酶活力的2个显著性因素：酵母膏和橄榄油。运用单因素试验研究非显著因素的最低添加量来降低生产成本，然后运用最陡爬坡试验找到中心复合试验的中心点，最后利用中心复合设计确定显著性因素之间的交互作用及最佳组成。结果表明：最佳培养基组分为酵母膏34 g/L、橄榄油5.92 mL/L、蔗糖12.5 g/L、CuSO4·5H2O 0.4 g/L、MnSO4·H2O 0.2 g/L，在此条件下脂肪酶酶活可达到9.27 U/mL，与模型预测值相近，且与单因素优化后的酶活(4.53 U/mL)相比，提高了104.64%。

假单胞菌；脂肪酶；响应面法；培养基优化

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)，又称三酰甘油酰基水解酶。在水相中，能将甘油三脂水解生成甘油一酯、二酯或者直接生成甘油和脂肪酸[1]。在非水相体系中，脂肪酶具有良好的脂化、转脂、醇解和胺解等特性[2]，该特性可使脂肪酶被广泛应用在药物合成、造纸、纺织、食品、化妆品等行业[3，4]。由于在食品行业中脂肪酶能水解底物生成饱和和不饱和的脂肪酸、羧酸和酮酸[5]，而这些物质是风味物质的主要组成成分，能提升食品的品质和口感，因此近年来脂肪酶被越来越多地应用在食品烘焙、乳制品和糖果的生产中[6，7]，以期望达到提升食品质量和增香的目的。

本研究以实验室筛选的假单胞菌(Pseudomonassp. HFE733)作为出发菌株，在前期单因素试验的基础上，利用响应面法对其液态发酵产脂肪酶的培养基成分进行优化，提高酶活的同时，降低了原料成本，为后期应用在增香乳制品上打下了坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

假单胞菌(Pseudomonassp.HFE733)： 实验室筛选保藏。

ZHWY系列双层恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；AR1140型电子分析天平 奥豪斯国际贸易(上海)有限公司；3K15冷冻离心机 德国Sigma公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ZSD-1270全自动生化培养箱；SW-CJ-1D型单人净化工作台 苏州净化设备有限公司；PHS-25 pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 培养基

种子培养基：葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO45 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨25 g/L，橄榄油10 mL/L；

发酵培养基：蔗糖12.5 g/L，酵母膏20 g/L，CuSO4·5H2O 0.5 g/L，MnSO4·H2O 0.5 g/L，橄榄油10 mL/L；

斜面保藏培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂粉20 g/L。

1.3 脂肪酶粗酶液的制备与酶活的测定

取假单胞菌(Pseudomonassp.HFE733)接种于种子培养基，在30 ℃，200 r/min条件下培养12 h；取5 mL(接种量10%)种子培养液接种于50 mL发酵培养基中，在30 ℃，220 r/min条件下培养60 h。4 ℃，8000 r/min离心15 min后取上清液即得粗酶液。

采用GB/T 23535-2009《脂肪酶制剂》中所述的酸碱滴定法测定脂肪酶酶活。脂肪酶酶活定义为：1 mL液体酶，在一定温度和pH条件下，1 min水解底物产生1 μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。

1.4 试验设计

1.4.1 Plackett-Burman设计

Plackett-Burman设计是以最少试验次数找到对脂肪酶酶活有显著性影响的因素(可信度大于95%的因素作为主效应)的试验方法[8]。选用试验次数N=12的试验设计，选取单因素优化试验中对菌株产脂肪酶影响较大的培养基的5个组分，每个因素取高低2个水平，高水平为“+”，低水平为“-”，以脂肪酶酶活(U/mL)为响应值Y。通过该设计进行试验，筛选出显著性因素进行下一步的试验。Plackett-Burman试验设计的各因素和水平见表 1。

表1 Plackett-Burman设计各因素与水平Table 1 Plackett-Burman design factors and levels

1.4.2 最低添加量试验

对于Plackett-Burman试验分析得出的不显著因素，为了简化培养基组分和降低成本，采用单因素试验确定这些培养基成分的最低添加量。

1.4.3 最陡爬坡试验

在Plackett-Burman试验设计得出的显著性因素后，对其最佳值区域进行进一步确定的实验方法。根据显著性因素效应值确定变化步长和变化方向，近一步靠近最佳值区域。找到拐点，为后续的中心复合设计提供试验依据。

1.4.4 Central Composite Design(CCD)响应面优化试验

根据Plackett-Burman设计及最陡爬坡试验的结果，通过二因素五水平的试验设计来确定假单胞菌的最适培养基成分。用软件Design Expert 8.0.6对试验进行试验设计回归分析，确定显著性因素的最佳添加量，依据回归方程绘制响应面三维立体分析图。CCD试验自变量水平的编码值和实际值见表2。

表2 中心复合设计各因素与水平Table 2 Central composite design factors and levels

1.5 验证试验

根据Design Expert 8.0.6由回归方程计算出显著性因素酵母膏和橄榄油产酶的最佳浓度，同时预测出在最佳浓度下的预测值。通过在各组分最佳浓度下所测得的实际酶活值与响应面预测值进行比较，以验证模型是否可靠，进而确定最终优化培养基组成。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验结果与分析

Plackett-Burman试验设计结果见表3。

续 表

对表3中的试验结果进行回归分析和方差分析，分析结果见表4和表5。

表4 Plackett-Burman设计回归分析Table 4 Regression analysis of Plackett-Burman design

注：模型在5%水平上差异显著，“*”代表显著因素；表5和表8与此同。

表5 Plackett-Burman设计方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman design

由Plackett-Burman设计回归分析可以看出，该回归模型的p值(prob>F)=0<0.05，则该模型在95%的置信区间内显著。酵母膏和橄榄油的p值分别为0.017和0.031，均小于0.05，则酵母膏和橄榄油在95%的置信区间内显著，而蔗糖、CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O的p值分别为0.139，0.273和0.505，均大于0.05，则蔗糖、CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O在95%的置信区间内不显著。由Plackett-Burman设计方差分析可以看出，其决定系数R2=0.7963，说明回归方程可以解释高达79.63%的试验数据。

2.2 最低添加量试验

根据Plackett-Burman试验，由于R2=0.7963<0.9，因此为了进一步提高数据的准确度，对不显著因素蔗糖、CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O做最低添加量实验，以期达到培养基成分最优最小的用量。

图1 最低添加量的试验设计与结果Fig.1 Design and results of the minimum additive amount experiment

由图1(a)可知，随着蔗糖添加量的增加，脂肪酶酶活逐渐增加，当蔗糖浓度为12.5 g/L时，脂肪酶酶活达到最大值8.58 U/mL；由图1(b)可知，随着硫酸铜添加量的增加，脂肪酶酶活逐渐增加，当硫酸铜浓度为0.4 g/L时，脂肪酶酶活达到最大值7.58 U/mL；由图1(c)可知，随着硫酸锰添加量的增加，脂肪酶酶活逐渐增加，当硫酸锰添加量为0.2 g/L时，脂肪酶酶活达到最大值为7.65 U/mL。故选择蔗糖、硫酸铜和硫酸锰的添加量分别为12.5，0.4，0.2 g/L。

2.3 最陡爬坡试验

为了进一步提高脂肪酶酶活，寻求发酵培养基的最优组合，根据Plackett-Burman试验的回归分析和方差分析，酵母膏为正效应，说明随着添加量水平逐步升高，脂肪酶酶活也会得到提高。反之，橄榄油为负效应，说明随着其添加水平的逐步降低，脂肪酶酶活将会得到提高。据此，设计了最陡爬坡试验，见表6。

表6 最陡爬坡试验设计及结果Table 6 Design and results of the steepest climbing experiment

由表6可知，第2组试验时脂肪酶酶活最高，即酵母膏和橄榄油的用量分别为30 g/L和6 mL/L时，酶活为7.20 U/mL，随着运行序的进一步增加，脂肪酶酶活逐渐降低。故选择酵母膏和橄榄油的添加量分别为30 g/L和6 mL/L作为中心复合设计的中心点。

2.4 中心复合试验设计(Central Composite Design)

经Plackett-Burman设计筛选得到2种显著影响脂肪酶酶活的培养基成分，即酵母膏和橄榄油，根据最陡爬坡试验得到中心复合试验的中心点，即酵母膏和橄榄油的添加量分别为30 g/L和6 mL/L。以此2种显著性因素的浓度为自变量，脂肪酶的酶活(U/mL)为响应值，进行二因素五水平的中心复合设计试验，其设计及结果见表7。

表7 中心复合设计及结果Table 7 Design and results of central composite

表8 中心复合设计回归分析Table 8 Regression analysis of central composite design

由表8可知，模型的p(prob>F)<0.05，说明模型具有显著性，该二次模型多元相关性系数R2=0.9593，表明预测仅有4.07%的变异情况不能由该模型解释，失拟项p值为0.6540表明失拟项不显著，模型没有失拟现象。A，A2和B2对酶活的影响显著。

通过二次模型回归系数的计算，得到如下方程以表征2个显著性因素酵母膏和橄榄油对脂肪酶酶活力的影响:

Y=10.13+0.18A+0.085B-0.15AB-0.57A2-0.43B2。

式中：Y代表脂肪酶的预测值(U/mL)，A和B分别代表酵母膏和橄榄油的质量浓度(g/L)。

根据Design Expert 8.0.6软件对回归方程中的交互项AB绘制响应面分析图，观察其对脂肪酶酶活的影响。

图2 酵母膏和橄榄油的交互作用对脂肪酶酶活影响的响应面图Fig.2 Response surface for interaction effects of yeast extract and olive oil on lipase activity

由图2可知，当酵母膏添加量不变时，随着橄榄油含量的增加，酶活力出现了先增大后减小的趋势。同样，当橄榄油含量不变时，随着酵母膏添加量的增加，酶活力也明显出现了先增大后减小的趋势，且曲面呈钟罩型，说明两者之间交互作用显著。

2.5 验证试验

通过Design Expert 8.0.6软件对回归方程求解，得出菌株产脂肪酶的最佳培养基组成为：酵母膏34 g/L、橄榄油5.92 mL/L，其他培养基成分为：蔗糖12.5 g/L、硫酸铜0.4 g/L、硫酸锰0.2 g/L，在此条件下做3次验证性试验，测得脂肪酶酶活平均值为9.27 U/mL。实测值与回归方程预测值9.91 U/mL相对误差很小，由此可见，用该回归模型优化假单胞菌(Pseudomonassp.HFE733)产脂肪酶进行的分析和预测是可行的，且具有实用价值。

3 结论

本研究以实验室自行筛选并保存的假单胞菌(Pseudomonassp. HFE733)为出发菌株，利用响应面法对其液体发酵产酶培养基成分进行优化，得到的最佳培养基组分为：酵母膏34 g/L、橄榄油5.92 mL/L、蔗糖12.5 g/L、硫酸铜0.4 g/L、硫酸锰0.2 g/L。在此条件下进行3次验证试验，试验结果(9.27 U/mL)与预测值(9.91 U/mL)基本吻合，说明运用响应面法优化假单胞菌产脂肪酶是合理可靠的，且酶活与单因素优化后的最大酶活力(4.53 U/mL)相比，提高了104.64%，为后期应用在增香乳制品上打下了坚实的基础。

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StudyonOptimizationofCultureMediumforLipaseProductionbyPseudomonassp.HFE733UsingResponseSurfaceMethodology

HU Jun, WANG Chang-gao, LIN Jian-guo, DU Xin, CAI Jun*

(Key Laboratory of Fermentation Engineering, Ministry of Education, Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

In this study, response surface methodology (RSM) is employed to optimize the fermentation culture medium for lipase production byPseudomonassp. HFE733 in submerged fermentation. Based on single factor experiments,two significant influence factors are screened by the method of Plackett-Burman design as: yeast extract and olive oil. To reduce the production cost, the minimum additive amount experiment is used to find out the minimum additive amount of non-significant factors, and the steepest ascent design is applied to obtain the center point of central composite design, and the optimal concentration and correlations of two factors are identified by central composite design. The result indicates that the optimal fermentation components for lipase production are as follows: yeast extract is 34 g/L, olive oil is 5.92 mL/L, sucrose is 12.5 g/L, CuSO4·5H2O is 0.4 g/L, MnSO4·H2O is 0.2 g/L. The enzyme activity in verification test reaches 9.27 U/mL, consistent with the model predicted value, which is 104.64% higher than that of single factor experiments' results (4.53 U/mL).

Pseudomonassp.； lipase；RSM；culture medium optimization

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.003

1000-9973(2017)12-0012-05

2017-06-15 *通讯作者

国家自然科学基金(31401807)

胡珺(1988-)，男，硕士，研究方向：发酵过程优化与放大;

蔡俊(1968-)，男，教授，博士，研究方向：微生物发酵工程。