成人跖疣人乳头瘤病毒分型及与临床特征的关系

董强 杨番 任英云 夏天保 尹萌萌 王泽锟 米霞 刘军连 曹晓佳 刘建军 葛芸 梁龙 吕世超

100101北京，安徽医科大学解放军第306临床学院皮肤科（董强、夏天保、尹萌萌、王泽锟、米霞、刘军连、曹晓佳、刘建军、葛芸、梁龙、吕世超）；天津市武清区人民医院医疗美容科（杨番）；佛山市南海区第三人民医院皮肤科（任英云）

成人跖疣人乳头瘤病毒分型及与临床特征的关系

董强 杨番 任英云 夏天保 尹萌萌 王泽锟 米霞 刘军连 曹晓佳 刘建军 葛芸 梁龙 吕世超

100101北京，安徽医科大学解放军第306临床学院皮肤科（董强、夏天保、尹萌萌、王泽锟、米霞、刘军连、曹晓佳、刘建军、葛芸、梁龙、吕世超）；天津市武清区人民医院医疗美容科（杨番）；佛山市南海区第三人民医院皮肤科（任英云）

目的 检测成人跖疣乳头瘤病毒（HPV）型别，并探讨HPV分型与临床特征的关系。方法 采用PCR扩增、基因测序和TA克隆技术检测221例跖疣患者疣体的HPV型，记录患者的年龄、病程、症状和疣体数。结果 221例标本中，HPV阳性率为97%（215/221）。单一HPV型占96%（206/215），HPV 27、2、57和7（Alpha属）分别占44.7%（92/206）、12.1%（25/206）、7.3%（15/206）和0.5%（1/206）；HPV 65（Gamma属）占0.5%（1/206）；HPV 1、63（Mu属）占33.5%（69/206）和1.5%（3/206）。HPV 27、2和57三型感染者之间年龄、病程、疣体个数、疼痛发生率和性别比较，差异均无统计学意义。与HPV 27感染者相比，HPV 1感染者与年龄≤30岁、病程≤1年、疣体数≤2个和疼痛高发生率相关。结论 HPV 27、2、57和1是感染成人跖疣患者的主要HPV型。HPV型与患者的临床特征间存在相关性。

乳头状瘤病毒科；基因分型技术；疣；PCR；临床特征；TA克隆

跖疣是由人乳头瘤病毒（HPV）引起的常见皮肤病，可因疼痛影响行走或运动，治愈率低。研究发现，引起跖疣的主要HPV型是Alpha属的2、27、57型，Mu属的1型和Gamma属的4、65型，分布可能存在地区差异［1-3］。HPV型和皮肤疣患者的临床特征有关［2-4］，并可能和冷冻、水杨酸的疗效及自然消退相关［5］。我们通过检测成人跖疣患者的HPV型，探讨HPV型分布及与临床特征的关系。

一、对象与方法

（一）对象：

1.共入选221例≥18岁跖疣患者。97例是2013年3月至2015年3月参加我科ND：YAG长脉冲1 064 nm激光和冷冻治疗跖疣随机对照研究中随机分配至冷冻治疗组的受试者；124例是2015年9月至2016年5月在我院皮肤科门诊就诊的跖疣患者。其中男146例，女75例，平均年龄31（19～73）岁，平均病程1.33（0.01 ～11.25）年，平均疣体数5（1 ～ 20）个。本研究方法通过医院医学伦理委员会批准，入选患者均签署知情同意书。

2.主要试剂和仪器：QIAamp DNA Mini Kit试剂盒（德国QIAgen公司），HPV L1区引物（北京华大基因公司），PCR扩增仪（ABI9700）、BDT V3.1试剂盒、测序仪（ABI3730XL）（美国ABI公司）。

（二）方法：

1.样本采集：无菌手术刀刮取患者首发疣体或面积最大疣体表面皮屑，放入无菌样品管中，低温保存，待测HPV型［6］。

2.DNA提取：使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取皮损标本中的病毒DNA。除消化时间延长至12 h外，其余步骤按说明书进行。

3.PCR扩增和电泳鉴定：用HPV L1区引物（正向引物5′-CARGGTCAYAAYAATGGYAT-3′，反向引物5′-AAYTTTC GTCCYARAGRAWATTGRTC-3′）和EX Taq扩增试剂扩增HPV的L1区基因。95℃变性5 min后进行PCR循环（95℃1 min，52℃2 min，72℃1 min，40个循环），4℃保温。凝胶电泳鉴定PCR产物，按磁珠纯化试剂盒说明书纯化扩增产物。

4.PCR产物测序和HPV分型：以纯化后的扩增产物为模板，加入带有不同荧光标记的双脱氧核糖核苷酸，通过PCR反应形成3′端带有不同荧光标记的不同长度的产物，扩增条件：96℃变性2 min；96℃ 10 s，55℃ 30 s，60℃ 3 min，共30个循环，16℃保温。产物经纯化后通过测序仪自动测序，最后经NCBI-BLAST数据库比对确定HPV型。若测序峰图是非单曲线，说明是多重感染，用TA Cloning技术确定HPV型。

5.多重感染的HPV型确定：纯化产物与Peasy-T1载体连接后转化进入DH5α感受态细胞，加500 μl SOC培养基，取200 μl培养液涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上，培养12 h，选5个白色菌落，95℃变性10 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃45 s，共30个循环，72℃延伸7 min。

（三）统计分析：用SPSS 19.0软件统计分析。多组及组间非正态分布计量资料比较用Kruskal-Wallis检验，两组间比较用Mann-Whitney U检验；计数资料比较用χ2检验。

二、结果

1.一般情况：共检出HPV阳性标本215份（97%）。215例HPV阳性患者中，男142例（66.4%），女73例（33.6%）；18～25岁患者56例（26.0%），26～30岁69例（32.1%），31～40岁51例（23.7%），＞40岁39例（18.1%）。病程0～0.5年患者88例（40.9%），0.6～1年40例（18.6%），1.1～2年41例（19.1%），＞2年46例（21.4%）。有1个疣体患者62例（29.1%），2～5个疣体82例（38.5%），6～10个疣体35例（16.6%），＞10个疣体34例（16.4%）。62.3%（134/215）的患者有疼痛症状；至少有一个镶嵌疣的患者占10.2%（22/215）。阴性标本6例，2例患者仅有1个疣体，2例2～5个，2例6～10个。

2.HPV分型结果：单一HPV型（单HPV型）感染的患者占96.0%（206/215），检出27、1、2、57、63、7和65共7个HPV型。多重感染的患者占4.0%（9/215），型别组合为HPV 1和27，HPV 1和2，HPV 2和27，HPV 1、2和27，分别为5例、2例、1例、1例。22例镶嵌疣均为单HPV型感染，包括HPV 27、2、1、7、57、63，分别为11例、5例、3例、1例、1例、1例。各HPV型分布结果见表1。

表1 跖疣患者HPV型构成比

3.HPV属和型与患者临床特征的关系：不同HPV属和型感染患者的临床特征见表2。Alpha属HPV（27/2/57型）感染者中位年龄、病程、疣体个数均显著高于Mu属HPV（1/63型）感染者（U=3310.000、1521.500、3544.000，均P ＜0.01），疼痛发生率显著低于Mu属（χ2=37.777，P＜0.001），Alpha和Mu属感染者性别比较，差异无统计学意义（χ2=0.555，P=0.456）。HPV 27、2和57感染者之间中位年龄、病程、疣体个数比较，差异无统计学意义（H=1.335、0.324、3.389，均P＞0.05），疼痛发生率和性别比较，差异无统计学意义（χ2=1.175、0.704，均P ＞ 0.05）。感染HPV 63的患者仅3例，未比较HPV 1和63患者的临床特征。

将HPV 27和HPV1感染者的年龄、病程、疣体个数按年龄≤30岁、病程≤1年、疣体数≤2个二分类后，比较两者临床特征差异。结果显示，除性别外，HPV 27感染者年龄≤30岁、病程≤1年、疣体数≤2个及疼痛的百分比均显著低于HPV 1型感染者，见表3。

表2 不同属或型HPV感染跖疣患者临床特征比较

表3 HPV 27和1型跖疣患者临床特征比较（例）

三、讨论

本研究结果显示，感染成人跖疣患者的主要HPV型 是 27、1、2 和 57，其中HPV 2/27/57型共占64.1%。Bruggink等［3］报道感染荷兰跖疣患者（≥ 4岁）的主要HPV型也是 1、27、57和 2，其中 HPV 2、27、57占 59%，HPV 1占29%。de Planell-Mas等［7］发现感染西班牙跖疣患者（≥ 4岁）的主要 HPV 型同样是57、27、1和2，其中HPV 2/27/57占76.1%，HPV 1占20.9%。以上结果说明，HPV2/27/57和HPV1可能是感染欧亚成人跖疣的主要HPV型，亚洲HPV 1的比例可能高于欧洲。

有报道，HPV型与患者临床特征相关，如HPV 1易感染年轻人［2-4］并和跖疣相关［1，5］，感染HPV 1的患者疣体数少、病程短［2-3］。本研究发现，与感染Alpha属HPV的患者相比，感染Mu属患者的年龄更小、病程更短、疣体个数更少，且疼痛发生率更高。将患者临床数据两分类后分析发现，感染HPV 1的成人跖疣患者具有年龄≤30岁、病程≤1年、疣体数≤2个及疼痛发生率高的临床特征，而感染HPV 27的患者相反。我们认为，HPV 1和27感染者疼痛发生率的差异可能导致病程和疣体数差异，所以疼痛可能是重要的临床特征；疼痛发生率的差异可能由不同属HPV型生物学特性决定。本文结果显示，HPV多重感染率为4.0%，HPV 1、27和2占比最多，提示多重感染的主要HPV型和单型感染基本一致。22例镶嵌疣均为单HPV型感染，HPV 2/7/27/57占81.7%，HPV 1/63占18.1%，提示Alpha的HPV型可能更易引起镶嵌疣。

志谢 北京大学生育健康研究所周玉博博士，北京奥康华医学检验所王燕飞检验师

［1］Hagiwara K,Uezato H,Arakaki H,et al.A genotype distribution of human papillomaviruses detected by polymerase chain reaction and direct sequencing analysis in a large sample of common warts in Japan［J］.J Med Virol,2005,77（1）:107-112.DOI:10.1002/jmv.20421.

［2］Rübben A,Kalka K,Spelten B,et al.Clinical features and age distribution of patients with HPV 2/27/57-induced common warts［J］.Arch Dermatol Res,1997,289（6）:337-340.

［3］Bruggink SC,de Koning MN,Gussekloo J,et al.Cutaneous wartassociated HPV types:prevalence and relation with patient characteristics［J］.J Clin Virol,2012,55（3）:250-255.DOI:10.1016/j.jcv.2012.07.014.

［4］Jabłońska S,Majewski S,Obalek S,et al.Cutaneous warts［J］.Clin Dermatol,1997,15（3）:309-319.

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［6］de Koning MN,Khoe LV,Eekhof JA,et al.Lesional HPV types of cutaneous warts can be reliably identified by surface swabs［J］.J Clin Virol,2011,52（2）:84-87.DOI:10.1016/j.jcv.2011.06.016.

［7］de Planell-Mas E,Martínez-Garriga B,Zalacain AJ,et al.Human papillomaviruses genotyping in plantar warts［J］.J Med Virol,2017,89（5）:902-907.DOI:10.1002/jmv.24713.

Relationship between human papillomavirus genotypes in and clinical characteristics of adult plantar warts

Dong Qiang,Yang Fan,Ren Yingyun,Xia Tianbao,Yin Mengmeng,Wang Zekun,Mi Xia,Liu Junlian,Cao Xiaojia,Liu Jianjun,Ge Yun,Liang Long,Lyu Shichao
Department of Dermatology,306th Clinical College of People′s Liberation Army,Anhui Medical University,Beijing 100101,China（Dong Q,Xia TB,Yin MM,Wang ZK,Mi X,Liu JL,Cao XJ,Liu JJ,Ge Y,Liang L,Lyu SC）;Department of Medical Cosmetology,The People′s Hospital of Wu Qing,Tianjin 301700,China（Yang F）;Department of Dermatology,The Third People′s Hospital,Nanhai District,Foshan City,Foshan 528200,Guangdong,China（Ren YY）

Lyu Shichao,Email:lvshichao@sina.com

Objective To investigate human papillomavirus（HPV）genotypes in adult patients with plantar warts,and to explore their relationship with clinical features of adult plantar warts.Methods PCR,gene sequencing and TA-cloning technique were performed to detect HPV types in 221 patients with plantar warts.Meanwhile,clinical data were recorded,including patients′age,disease duration,symptoms and number of warts.Results Of 221 specimens,HPV DNA was detected in 215,with the HPV-positive rate being 97%.Single HPV infections were detected in 206 specimens（96%,206/215）,among which,HPV types included HPV-27（44.7%,92/206）,-2（12.1%,25/206）,-57（7.3%,15/206）,-7（Alpha genus;0.5%,1/206）,-65（Gamma genus;0.5%,1/206）,-1（33.5%,69/206）and-63（Mu genus;1.5%,3/206）.There were no significant differences in age,disease duration,number of warts,incidence of pain and gender among patients with HPV-27,-2 or-57 infections.Compared with patients with HPV-27 infection,patients with HPV-1 infection were more related to age≤30 years,disease duration≤1 year,number of warts≤2 and high incidence of pain.Conclusion HPV-27,-2,-57 and-1 are the main types in adult patients with plantar warts,and HPV types are correlated with clinical features of adult plantar warts.

Papillomaviridae;Genotyping techniques;Warts;PCR;Clinical features;TA cloning

吕世超，Email：lvshichao@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.013

首都临床特色应用研究（Z141107002514179）

Fund program:Capital Clinical Characteristic Application Research（Z141107002514179）

2016-12-01）

（本文编辑：尚淑贤）