春兰离体再生体系的研究

王波 刘文海

（潍坊工程职业学院花卉学院 山东青州 262500）

春兰离体再生体系的研究

王波 刘文海

（潍坊工程职业学院花卉学院 山东青州 262500）

以春兰种子为外植体进行再生体系建立试验，采用正交试验方法研究基础培养基、激素浓度、天然添加物对原球茎诱导、增殖、分化的影响，筛选出适合快繁各阶段的培养体系。研究结果表明，种子诱导原球茎的最适培养基为1/2MS+2.0mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+活性炭2.0g/L；原球茎增殖培养基为1/2MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA+100ml/L椰乳+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+活性炭2.0g/L；原球茎分化培养基为1/2MS+0.5mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LKT+150ml/L椰乳+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+活性炭2.0g/L。

春兰；种子；原球茎诱导

春兰，兰科兰属植物，是我国兰花栽培历史最为悠久的种类之一。叶带形，叶态优美；花色以绿色、淡褐黄色居多，花幽香，有重要观赏价值[1]。由于长期无节制的乱采滥挖，野生资源已枯竭。目前春兰常用种子和分株法繁殖，其种子的胚多半不成熟或发育不全，这样的种子是比较难以发芽的；自然的分株方法，繁殖系数很低[2]，采取组织培养方法可以加快繁殖速度。但组织培养中外植体的选择尤为重要，采用茎尖、侧芽等器官对母株伤害较大，并且芽容易褐化难以启动，而采用种子为外植体可避免母株的损伤，对保护珍稀春兰资源具有重要的参考意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

购于山东绿圣兰业花卉科技有限公司，经人工授粉后，取其种子。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒

取健壮植株上生长7～9个月未开裂的蒴果，自来水冲洗30min，超净台中75%酒精消毒5min，再用0.1%升汞溶液消毒10min，无菌水冲洗。于超净台上剖开蒴果，取种子备用。

1.2.2 种子预处理

根据黄磊方法[3]，种子萌发阶段采用10%NaClO溶液处理20min。

1.2.3 种子萌发与原球茎诱导

采用三因素三水平正交试验设计确定最佳培养基和激素组合（表1）。将预处理的种子接种到不同的培养基中，每个蒴果接种3瓶，每个处理重复3次，培养15周后以原球茎诱导数量作为观察指标。培养基为基本培养基+NAA+6-BA+蔗糖30g/L+琼脂 7.5g/L+活性炭 2.0g/L，PH5.5。培养条件：温度（25±1℃），光照强度2000lx，时间12h/d。

表1 L9（33）正交试验因素水平设计

1.2.4 原球茎的增殖

将上述试验条件下生长良好的原球茎，用无菌镊子掰成大小均匀的小块，接种于不同激素和天然添加物配比的培养基中（表2），每个处理接种5个。接种后置于25℃，光照12h/d，光照强度2000lx条件下培养，60d后调查其增殖情况，统计新增殖的原球茎总数。

表2 原球茎增殖培养基正交试验因素水平设计

1.2.5 原球茎的分化

取生长健壮、大小均匀的原球茎接种到添加不同激素和天然添加物配比的分化培养基中（表3），每个处理集中10个。接种后置于25℃，光照12h/d，光照强度2000lx条件下培养，60d后调查其分化情况，统计原球茎分化出芽的总数。

表3 原球茎分化培养基正交试验因素水平设计

2 结果与分析

2.1 种子萌发与原球茎诱导

将经过10%NaClO溶液处理后的种子接种到不同基础培养基和激素配比中，培养15周后统计诱导率，试验结果表明（表4），不同处理之间诱导率出现明显差异，极差分析表在所设置的3个因素基础培养基、NAA、6-BA，NAA对原球茎的诱导率影响较大，其次为6-BA和基础培养基。综合分析极差结果，该试验最佳培养基配比为1/2MS+2.0mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+活性炭2.0g/L。

2.2 原球茎增殖培养

将生长良好的原球茎接种到不同的增殖培养基中。以NAA、6-BA、椰乳为因素设置试验。原球茎培养10d后开始出现增殖现象，新增原球茎黄绿色。9组试验原球茎的增殖倍数出现差异（表5），极差分析表明所设置的3个因素基中NAA和6-BA对原球茎的增殖影响较大，其次为天然添加物。综合分析极差结果，该试验最佳培养基配比为1/2MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA+100ml/L椰乳+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+活性炭2.0g/L。

表4 原球茎诱导试验结果分析

表5 原球茎增殖试验结果分析

2.3 原球茎分化培养条件

将生长一致且健壮的原球茎接种到不同的分化培养基中。以NAA、6-BA、KT、椰乳为因素设置试验。9组试验原球茎的分化率出现较大差异（表6），试验组5原球茎分化率最高。极差分析表明NAA、6-BA、KT、椰乳四个因素对试验结果的顺序为NAA＞KT＞6-BA＞椰乳。原球茎分化最佳培养基配比为1/2MS+0.5mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LKT+150ml/L椰乳+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+活性炭2.0g/L。

3 结论

鉴于自然条件下，春兰分株繁殖效率低，种子难以萌发的技术难题，本研究综合春兰组织培养的诱导、增殖、分化阶段，以种子为外植体初步建立了春兰组织培养繁殖体系。研究结果表明，种子诱导原球茎的最适培养基为1/2MS+2.0mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+活性炭2.0g/L；原球茎增殖培养基为1/2MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA+100ml/L椰乳+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+活性炭2.0g/L；原球茎分化培养基为1/2MS+0.5mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LKT+150ml/L椰乳+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+活性炭2.0g/L。

表6 原球茎分化试验结果分析

[1]丁永康.中国兰花[M].成都：四川科学技术出版社，2008，8.

[2]刘道敏，荣维国，郝睿.国兰“绿蕙红舌”的组织培养技术[J].安徽农业大学学报，2012，39（4）：656～659.

[3]黄 磊.春兰种子非共生萌发的研究[J].种子，2003（6）：40～41.

S642.5

A

1005-7897（2017）22-0009-02

2017-9-6