脂多糖介导的TLR4信号通路在膀胱癌免疫逃逸中的作用及其机制

吴高亮 周伟敏 齐雪亮 胡 涌 黄 骥 郝 超

(江西省肿瘤医院泌尿外科，江西 南昌 330029)

脂多糖介导的TLR4信号通路在膀胱癌免疫逃逸中的作用及其机制

吴高亮 周伟敏 齐雪亮 胡 涌 黄 骥 郝 超

(江西省肿瘤医院泌尿外科，江西 南昌 330029)

目的探讨脂多糖介导的Toll样受体(TLR)4信号通路活化在膀胱癌(BC)T24细胞系免疫逃逸中的作用及其机制。方法取对数生长期T24细胞，使用1 μg/ml的脂多糖分别刺激该细胞0、6、12、24 h，采用流式细胞仪检测细胞表面TLR4的表达量，采用RT-PCR检测细胞中程序性死亡配体-1(PD-1,又称B7-H1)mRNA的表达，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中B7-H1 蛋白的表达，分析TLR4表达与B7-H1 mRNA及其蛋白的相关性。结果TLR4阳性率随刺激时间的增长而上调，且在12 h时达到最高值，24 h时表达略有降低，但仍较高。6、12、24 h时TLR4阳性率与0 h时比较差异有统计学意义(Plt;0.05)。RT-PCR及ELISA结果显示B7-H1 mRNA及蛋白的表达随刺激时间的增长而上调，且在12 h时达到最高值，24 h时表达略有降低，但仍较高。与0 h时比较，6 h和24 h T24细胞B7-H1 mRNA及蛋白表达量增高(Plt;0.05)，12 h 显著增高(Plt;0.01)。TLR4与B7-H1 mRNA呈正相关(r=0.785，P=0.002)，TLR4与B7-H1 蛋白呈正相关(r=0.825，P=0.012)。结论脂多糖能活化TLR4信号通路，并上调B7-H1 mRNA及其蛋白的表达，可能参与BC细胞免疫逃逸，为BC的靶向治疗提供新思路。

Toll样受体4；程序性死亡配体-1；蛋白表达；膀胱癌；免疫逃逸

膀胱癌(BC)是发病率最高的泌尿系统恶性肿瘤，可分为表浅性BC(Ta～1及原位癌Tis)和浸润性BC(T2～4)两大类，其中浸润性BC占总体的80%，具有易发生转移、预后较差、术后生存率较低等特点〔1〕初次治愈后复发率高达70%～80%。Toll样受体(TLR)4是一种免疫调节因子，参与机体免疫应答的起始阶段，正常情况下仅表达于机体免疫细胞表面，病理状态下表达于多种恶性肿瘤细胞表面〔2〕。程序性死亡配体(PD)-1又称B7-H1，可以通过与受体PD-1的结合对某些细胞因子的分泌和T细胞的增殖产生抑制作用，或与肿瘤细胞的免疫逃逸密切相关〔3〕。目前，关于TLR4信号通路和B7-H1在肺癌、套细胞淋巴癌细胞等中的免疫逃逸过程已有报道〔4,5〕，但是在BC细胞中的免疫逃逸机制鲜见报道。本文利用脂多糖介导的TLR4信号通路活化，研究TLR4信号通路和B7-H1在BC免疫逃逸中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1细胞及试剂 人BC细胞系T24细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，青霉素、链霉素(Sigma公司)，胎牛血清、胰蛋白酶、培养液 RPMI1640培养基(HyClone 公司)，Trizol reagent(Invitrogen公司)，鼠抗人TLR4单克隆抗体(Biolegend公司)，RT-PCR试剂盒(LifeInvitrogen公司)，PCR引物由LifeInvitrogen公司合成。PierceTM BCA Protein Assay Kit(Thermo公司)，B7-H1 ELISA kit(LifeInvitrogen)。

1.1.2实验仪器 流式细胞仪(BD Biosciences)，Real-Time PCR System(model 7500，Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA)，PCR System 9700(GeneAmp)，酶标仪(BIO-RAD Model680，Japan),低温高速离心机(Centrifuge 5810 R，eppendorf)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 使用RPMI1640培养基(含10%胎牛血清、浓度为100 U/ml青霉素和100 μg/ml硫酸链霉素)，在温度37℃，体积分数为5%的CO2饱和湿度的恒温培养箱中对BC T24细胞进行常规培养，每2 d按照1∶2或1∶3的比例传代。

1.2.2TLR4信号通路活化 取对数生长期T24细胞，0.25%胰酶消化完全后，加入适当的完全培养基终止消化，1 500 r/min离心3 min，弃去上清后，以新鲜完全培养液重新悬浮，细胞计数仪计数，将细胞悬浮液稀释至1.5×105cells/ml，以2 ml/孔接种于6孔培养板中，24 h后加入含有1 μg/ml的脂多糖，继续孵育0、6、12和24 h。

1.2.3流式细胞仪检测TLR4表达 按时间点收集细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，加入适当的完全培养基终止消化，1 500 r/min离心3 min，弃去上清，冰磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，重复3次，加入PE标记的鼠抗人TLR4单克隆抗体，在4℃的温度下避光孵育30 min，孵育完毕后，冰PBS洗涤3次，将细胞团块完全悬浮于冰PBS中，加入200 μl 4%多聚甲醛固定细胞，采用流式细胞仪检测TLR4表达。

1.2.4RT-PCR测定B7-H1 mRNA表达 按时间点取脂多糖孵育结束的6孔板，弃去上清，加入1 ml/孔的Trizol裂解液，裂解细胞，按照相分离-沉淀RNA-洗涤RNA-RNA再溶解的步骤，提取各组T24细胞中总RNA。测量各组总RNA浓度，分别取等量的总RNA逆转录合成cDNA。测量逆转录后的各组cDNA浓度，分别取等量的cDNA进行RT-PCR，设定条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min。40个循环：95℃ 15 s，60℃ 1 min。B7-H1上游引物序列：5′-GCCGATACAAGCGAATTA-3′，下游引物序列：5′-TCTCAGTGTGCTGGTCTGGTCACAT-3′，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，上游引物序列：5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物序列：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，采用PCR System 9700进行分析，运用2-△△Ct法相对定量检测各组 mRNA 的表达量。

1.2.5ELISA测定B7-H1蛋白表达 按时间点取脂多糖孵育结束的6孔板置于冰上，弃去上清，用冰PBS洗3遍，再加入1 ml/孔的冰PBS，用细胞刮仔细完全地刮下细胞。将刮下的含有细胞的PBS液转移离心管内，3 000 r/min，4℃离心5 min，弃去上清液，加入250 μl/孔的混合裂解液，反应30 min。反应完毕后，12 000 r/min，4℃离心10 min，取上清液。测定牛血清蛋白标准品(BCA)的标准曲线，计算各组样品的总蛋白浓度。各组样品取等量的总蛋白，按照B7-H1 ELISA试剂盒的规定步骤处理蛋白，用酶标仪测量各孔的吸光度，根据测定的B7-H1蛋白标准曲线，计算各组样品对应的蛋白浓度。

1.3统计学方法 应用SPSS17.0软件进行χ2、t检验、Spearman相关性分析。

2 结 果

2.1脂多糖刺激时间对TLR4表达的影响 以1 μg/ml的脂多糖分别刺激T24细胞0、6、12、24 h，流式细胞仪检测结果显示TLR4阳性率随刺激时间的增长而上调，且在12 h时(27.76%，3 551/12 790)达到最高值，24 h时(22.49%，3 057/13 590)表达略有降低，但仍较高。6 h(14.65%，1 856/12 672)、12 h、24 h时TLR4阳性率与0 h(3.55%，533/15 024)时比较差异有统计学意义(Plt;0.05)。

2.2B7-H1 mRNA及蛋白表达结果 B7-H1 mRNA、蛋白的表达随刺激时间的增长而上调，且在12 h时达到最高值，24 h时表达略有降低，但仍较高。与0 h时比较，6 h和24 h T24细胞B7-H1 mRNA、蛋白表达量增高(Plt;0.05)，12 h显著增高(Plt;0.01)。见表1。

2.3相关性分析 TLR4与B7-H1 mRNA、蛋白呈正相关(r=0.785，0.825；P=0.002，0.012)。

表1 B7-H1 mRNA、蛋白表达结果

与0 h比较：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01

3 讨 论

细胞介导的细胞免疫是一种机体抗肿瘤免疫的形式〔6〕，肿瘤抗原被机体免疫系统识别和提呈，对特异性细胞起到活化作用，进而杀伤肿瘤细胞。罗斌等〔7〕研究发现，肿瘤细胞可以通过缺如某些免疫分子和(或)异常表达，导致特异性细胞处于免疫耐受或无反应状态，进而避开机体的免疫杀伤作用，这种现象既是免疫逃逸。随着分子生物学的不断发展和蛋白组学技术的研究深入，BC发生发展相关的特异性蛋白因子逐渐被发现，包括存活素(survivin)、凋亡抑制蛋白(livin)等〔8，9〕。Rosborough等〔10〕在研究中利用基因沉默(RNAi)技术，采用载有survivin siRNA的脂质体对原位BC小鼠模型进行治疗，可发现在治疗的3 w内，survivin mRNA的表达较治疗前降低了70%，且肿瘤体积也有所降低，说明分子靶向survivin可作为临床治疗BC的新思路。livin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新发现的一员，研究表明转染livin的反义寡核苷酸于BC细胞中可抑制livin的表达及细胞增殖，同时激活细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶caspase-3，促进癌细胞凋亡。这些因子虽然被发现，但是其在BC的发生、发展、转移过程中的作用机制和相互作用尚未完全明确，因此本次研究信号通路及相关蛋白表达，以期为BC的靶向治疗提供依据。

B7家族分子在多种造血干细胞恶性肿瘤、实体瘤和浸润性免疫细胞中均表达，研究发现膀胱肿瘤中存在共刺激因子B7-H1的高表达。本研究说明脂多糖的确可以活化TLR4信号通路，增加T24细胞表面TLR4的表达量。且TLR4的影响下B7-H1 mRNA及蛋白表达升高，TLR4与B7-H1 mRNA及蛋白表达呈正相关。B7-H1是新近发现的共刺激因子，其与T细胞、B细胞表面的PD-1分子结合，可提供抑制性信号，抑制两者的活化和增殖，并可诱导细胞毒性T细胞(CTL)凋亡。Huang等〔11〕研究发现抑制体外培养的BC T24细胞系细胞外信号调节激酶、C-Jun N端激酶(ERK、JNK)信号通路后，TLR4介导的B7-H1表达上调作用被削弱，提示丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的活化可能参与了B7-H1相关的膀胱肿瘤免疫逃逸过程。另外还有研究证实B7-H1可诱导Treg表面的Fas/FasL表达上调，促进白细胞介素-10(IL-10)的分泌以诱导活化的细胞凋亡〔12〕。还有研究〔13〕发现，自然杀伤(NK)细胞在B7-H1表达缺失的情况下仍能增强CTL的杀伤作用，阻断B7-H1后则可增强鼠结肠炎性免疫应答。

1李 哲，魏素菊，刘风玲，等.循环肿瘤细胞监测早期膀胱癌微转移的价值〔J〕.肿瘤防治研究，2015；42(7)：740-2.

2Rajaiah R，Perkins DJ，Ireland DD，etal.CD14 dependence of TLR4 endocytosis and TRIF signaling displays ligand specificity and is dissociable in endotoxin tolerance〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2015；112(27)：8391-6.

3Bardoli AD，Afshar M，Viney R，etal.The PD-1/PD-L1 axis in the pathogenesis of urothelial bladder cancer and evaluating its potential as a therapeutic target〔J〕.Future Oncol，2016；12(5)：595-600.

4郜 亮，冯向先.Toll样受体4在恶性黑色素瘤中的表达及其介导肿瘤免疫逃逸的机制〔J〕.中华实验外科杂志，2015；32(6)：1387-90.

5Wang L，Qian J，Lu Y，etal.Immune evasion of mantle cell lymphoma：expression of B7-H1 leads to inhibited T-cell response to and killing of tumor cells〔J〕.Haematologica，2013；98(9)：1458-66.

6张 荻，陈宜恬，李荣荣，等.CD_4～+CD_(25)～+Treg细胞介导的肿瘤免疫机制探析〔J〕.中华中医药学刊，2014；35(12)：2886-9.

7罗 斌，田建辉，刘嘉湘，等.循环肿瘤细胞免疫逃逸的研究进展〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2015；22(23)：1856-60.

8黄益恒，周 念，徐 勋，等.联合检测特异性核基质蛋白-4、膀胱癌抗原在膀胱癌早期诊断中的意义〔J〕.实用医学杂志，2014；30(22)：3608-10.

9晋学飞，吴 冰，谭九峰，等.生存素、Livin和zeste同源物-2在膀胱癌组织中的表达〔J〕.中华实验外科杂志，2015；32(6)：1230-2.

10Rosborough BR，Raïch-Regué D，Matta BM，etal.Murine dendritic cell rapamycin-resistant and rictor-independent mTOR controls IL-10，B7-H1，and regulatory T-cell induction〔J〕.Blood，2013；121(18)：3619-30.

11Huang X，Chen Y，Chung CS，etal.Identification of B7-H1 as a novel mediator of the innate immune/pro-inflammatory response as well as a possible myeloid cell prognostic biomarker in sepsis〔J〕.J Immunol，2014；192(3)：1091-9.

12林 城，陈 雄，刘静南，等.PD-1/PD-L1信号通路在非小细胞肺癌免疫逃逸及其治疗中的研究进展〔J〕.中国肺癌杂志，2014；17(10)：734-40.

13李旭宏，王晓波，余少鸿，等.NK细胞上清液提高CTL细胞对肝癌细胞杀伤力的研究〔J〕.检验医学与临床，2016；13(z1)：62-5.

〔2017-01-19修回〕

(编辑 袁左鸣)

R73

A

1005-9202(2017)22-5528-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.018

江西省自然科学基金资助项目(No.20161BAB205271)

吴高亮(1978-)，男，硕士，副主任医师，主要从事泌尿系肿瘤研究。