西格列汀对2型糖尿病大鼠Nrf2表达调控及胰岛β细胞功能的影响

霍 雯 郑 倩 王 涛 高 瑛 许 薇 张成华

(川北医学院，四川 南充 637000)

西格列汀对2型糖尿病大鼠Nrf2表达调控及胰岛β细胞功能的影响

霍 雯 郑 倩 王 涛 高 瑛 许 薇 张成华

(川北医学院，四川 南充 637000)

目的研究西格列汀对2型糖尿病大鼠Nrf2表达调控及胰岛β细胞功能的影响。方法雄性Wistar大鼠80只适应性饲养1 w后，采用随机数字表选取20只胰岛β细胞功能指数作为正常对照组，其余60只构建2型糖尿病模型，造模成功后根据随机数字表分为模型组和治疗组，每组20只。模型组灌胃0.9%生理盐水，治疗组灌胃0.9%生理盐水配制的西格列汀，给药剂量为100 mg·kg-1·d-1，灌胃周期为20 w。对各组大鼠胰岛β细胞功能，Nrf2表达水平进行分析。结果干预20 w后，治疗组血糖水平显著低于模型组(Plt;0.05)，血清胰岛素水平显著高于模型组(Plt;0.05)。治疗组(HBCI)、胰岛β细胞分泌功能指数(FBCI)显著均高于模型组(Plt;0.05)。治疗组大鼠血清和胰腺丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α显著低于模型组(Plt;0.05)。治疗组大鼠血清和胰腺总超氧化物歧化酶(T-SOD)均显著高于模型组(Plt;0.05)。治疗组大鼠Nrf2表达水平显著高于模型组(Plt;0.05)。结论西格列汀可显著上调2型糖尿病大鼠Nrf2表达水平，改善其胰岛β细胞功能，对2型糖尿病具有确切的临床疗效。

西格列汀；2型糖尿病；Nrf2；胰岛β细胞

糖尿病患者由于长期受到高糖刺激，使胰岛β细胞功能严重受损。此外，在高血糖刺激下，机体产生大量自由基，造成机体氧化应激，而胰岛组织的抗氧化能力比机体其他组织弱，其超氧化物歧化酶(SOD)的量仅为肝脏的30%～40%，谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的含量仅为5%～15%，因此胰岛组织受到氧化应激损伤的风险更大〔1,2〕。Nrf2/ARE是细胞内重要的抗氧化信号通路〔3〕。西格列汀治疗糖尿病临床疗效确切，但其作用机制尚不明确。本研究拟探讨西格列汀对2型糖尿病大鼠Nrf2表达调控及胰岛β细胞功能的影响。

1 材料与方法

1.1材料 链脲佐菌素、戊巴比妥钠均购自美国Sigma公司，叔丁基对苯二酚购自比利时Acros公司，胰岛素放射免疫分析试剂盒购自北京北方生物技术研究所，丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(TSOD)、肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司，兔抗大鼠Nrf2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2动物及分组 体重180～200 g的雄性Wistar大鼠80只适应性饲养1 w后，采用随机数字表选取20只大鼠作为对照组，其余60只大鼠采用高糖高脂饮食喂养4 w，再一次性腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg，注射72 h后检测血糖，血糖水平≥16.7 mmol/L为造模成功。之后将造模成功的大鼠根据随机数字表分为模型组和西格列汀治疗组，每组20只。模型组灌胃0.9%生理盐水，治疗组于每日早上9：00～10：00灌胃0.9%生理盐水配制的西格列汀，给药剂量为100 mg·kg-1·d-1，灌胃周期为20 w。

1.3标本采集 各组大鼠标本采集前禁食12 h，以10%水合氯醛0.3 ml/100 g进行腹腔注射，麻醉完成后，将大鼠四肢朝上固定，消毒后打开腹腔、暴露腹部。分离腹主动脉，用采血针斜面向上刺向近心端，抽取约5 ml至肝素抗凝管，静置30 min后3 000 r/min离心10 min，分离上清-80℃冻存备用。找到胰腺迅速分离并摘取，注意无菌，冰生理盐水冲洗后用无菌纱布吸干，放入液氮罐速冻，再转入-80℃冰箱保存备用。

1.4观察指标及方法 (1)血糖及血清胰岛素测定：分别在适应性饲养1 w、造模后及干预20 w后采用血糖检测仪检测各组大鼠空腹血糖(FPG)，采用ELISA法检测各组大鼠血清胰岛素水平，同时评估各组大鼠胰岛β细胞功能，胰岛β细胞功能指数(HBCI)=20×Fins/(FPG-3.5)；胰岛β细胞分泌功能指数(FBCI)=Fins/FPG。(2)相关指标测定：在西格列汀干预结束后分别采集各组大鼠血清和胰腺，分别测定MDA、TNF-α和T-SOD水平。(3)Nrf2表达水平的测定：干预20 w后，采集各组大鼠胰尾组织100 mg，进行蛋白提取、定量，取等量蛋白用于10%SDS-PAGE，然后将蛋白转移至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶封闭，加入一抗溶液兔抗大鼠Nrf2(1∶800)，标准内参兔抗大鼠GAPDH(1∶1 000)，4℃孵育过夜后加入相应的二抗溶液，室温孵育1 h，采用增强化学发光法显色，再进行凝胶成像系统成像，测定灰度值。

1.5统计学处理 采用SPSS22.0软件进行F检验及LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组大鼠血糖、血清胰岛素水平比较 1 w时，各组大鼠血糖、血清胰岛素水平均无统计学差异(Pgt;0.05)。造模后，对照组大鼠血糖水平显著低于模型组(Plt;0.05)和治疗组(Plt;0.05)，血清胰岛素水平显著高于模型组(Plt;0.05)和治疗组(Plt;0.05)。干预20 w后，治疗组血糖水平显著低于模型组(Plt;0.05)，血清胰岛素水平显著高于模型组(Plt;0.05)，差异均有统计学意义，见表1。

表1 各组大鼠血糖、血清胰岛素水平

与对照组比较：1)Plt;0.05；与模型组比较：2)Plt;0.05；下表同

2.2各组大鼠胰岛β细胞功能相关指数比较 1 w时，各组大鼠HBCI、FBCI差异均无统计学意义(Pgt;0.05)；造模后，对照组大鼠HBCI、FBCI显著均显著高于模型组(Plt;0.05)和治疗组(Plt;0.05)；干预20 w后，治疗组HBCI、FBCI显著均高于模型组(Plt;0.05)，见表2。

2.3各组大鼠干预20 w后血清和胰腺丙二醛(MDA)，肿瘤坏死因子(TNF)-α和T-SOD水平 对照组大鼠血清和胰腺MDA、TNF-α均显著低于模型组和治疗组，治疗组大鼠血清和胰腺MDA、TNF-α显著低于模型组(Plt;0.05)；对照组大鼠血清和胰腺T-SOD均显著高于模型组和治疗组，治疗组大鼠血清和胰腺T-SOD均显著高于模型组，见表3。

2.4干预20 w后各组大鼠Nrf 2表达水平分析 对照组大鼠Nrf2表达水平显著高于模型组(Plt;0.05)；治疗组大鼠Nrf2表达水平显著高于模型组(Plt;0.05)，见图1。

表2 各组大鼠胰岛β细胞功能比较

表3 各组大鼠干预20 w后血清和胰腺MDA，TNF-α和T-SOD水平比较

图1 各组大鼠Nrf2表达水平

3 讨 论

糖尿病患者体内长期的高血糖刺激，引起机体长期处于氧化应激状态，从而导致胰岛β细胞氧化损伤，进而影响胰腺分泌胰岛素的功能，造成病情加重，因此在糖尿病临床治疗中对胰岛β细胞功能的评估很重要〔4,5〕。此外，有研究表明，通过抗氧化剂清除高糖作用引起的胰岛β细胞内升高ROS能够促进其胰岛素分泌功能的恢复，而Nrf2是目前已经证实的与细胞抗氧化能力密切相关的核转录因子〔6〕。

本研究所采用的造模方法成功构建了2型糖尿病大鼠模型，为此后的药物干预奠定了基础。证实了西格列汀对2型糖尿病具有确切疗效，同时能够显著改善胰岛β细胞功能。

MDA是反映机体氧化应激状态的重要指标，TNF-α是胰岛β细胞慢性炎症反应的关键的炎症因子，而SOD是Nrf2的一个下游靶基因，具有较强的清除自由基和炎症因子的作用〔7～9〕。本研究结果表明西格列汀能够增加SOD水平，从而清除2型糖尿病大鼠体内的炎症因子和氧自由基，从而缓解机体的氧化应激程度和炎症，进而改善病情。西格列汀能够显著提高2型糖尿病大鼠体内Nrf2的表达水平，通过相关通路刺激使SOD水平升高，进而清除氧自由基、炎症因子。Nrf2能够保护胰岛β细胞免受氧化反应的损伤，减少细胞死亡，从而使氧化应激相关的胰岛素分泌减少得到缓解，有助于病情的改善。

综上，西格列汀可显著上调2型糖尿病大鼠Nrf2表达水平，改善其胰岛β细胞功能，对2型糖尿病具有确切的临床疗效。

1Ceriello A，Motz E.Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlying insulin resistance，diabetes，and cardiovascular disease? The common soil hypothesis revisited〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004;24(5):816-23.

2胡亚飞,苏文进,贾文波,等.糖尿病前期和2型糖尿病患者体内氧化抗氧化状态研究〔J〕.营养学报,2007;52(3):232-4,238.

3张 靖,谭亲友.Nrf2-ARE信号通路功能与临床疾病及相关药物的研究新进展〔J〕.中国医院药学杂志,2016;36(15):1-6.

4王 尧,黄 欢,王艳萍,等.糖尿病患者血糖波动与氧化应激状态的相关性研究〔J〕.中国全科医学,2011;14(23):2606-8.

5周 玉,王伶俐,黄 杨,等.糖尿病大鼠的SOD活性与抗氧化剂治疗对机体抗氧化状态的影响〔J〕.中国实验动物学报,2016;24(4):422-6.

6廖 霞,郑少杰,卢可可,等.植物多酚通过Nrf2/ARE信号通路抗氧化作用研究进展〔J〕.食品科学,2016;37(7):227-32.

7Lee YS,Cheon IS,Kim BH,etal.Loss of extracellular superoxide dismutase induces severe IL-23 mediated skin inflammation in mice〔J〕.J Invest Dermatol,2013;133(3):732-41.

8Li C,Zhou HM.The role of manaese superoxide dismutase in inflammation defense〔J〕.Enzyme Res,2011;112:387176.

9Mansuroglu B,Derman S,Yaba A,etal.Protective effect of chemically modified SOD on lipid peroxidation and antioxidant status in diabetic rats〔J〕.Int J Biol Macromol,2015;72(1):79-87.

〔2017-02-20修回〕

(编辑 李相军)

EffectofsitagliptinonpancreaticbetacellfunctionandtheexpressionofNrf2intype2diabeticrats

HUOWen,ZHENGQian,WANGTao,etal.

NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China

ObjectiveTo study the effect of sitagliptin on pancreatic beta cell function and the expression of Nrf2 in type 2 diabetic rats.Methods80 male Wistar rats were fed for 1 week, as 20 rats were selected as normal control group according to the random number table, then construct the model of type 2 diabetes mellitus. The remaining 60 rats were randomly divided into model and treatment groups, 20 rats in each group. After the success of modeling, the model group was orally administered with 0.9% saline, and the treatment group was given sitagliptin dissolved with 0.9% saline.ResultsAfter 20 weeks of treatment, the blood glucose level of treatment group was significantly lower than that of model group (Plt; 0.05), serum insulin level was significantly higher than that of model group (Plt;0.05). The levels of HBCI, FBCI in treatment group were significantly higher than those in model group (Plt;0.05). The levels of serum MDA, TNF- alpha and MDA in pancreatic of treatment group were significantly lower than those in model group (Plt;0.05).The levels of T-SOD in serum and pancreas in treatment group were significantly higher than those in model group. The expression level of Nrf2 of treatment group was significantly higher than that of model group (Plt;0.05).ConclusionsSitagliptin could upregulate Nrf2 expression in type 2 diabetic rats, improve the function of islet beta cells, which has definite clinical effect on type 2 diabetes.

Sitagliptin; Type 2 diabetes; Nrf2; Pancreatic beta cell function

R587

A

1005-9202(2017)22-5503-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.008

国家自然科学基金(青年科学基金)项目(No.21503026)

张成华(1985-)，男，博士，讲师，主要从事基础医学及教学研究。

霍 雯(1988-)，女，硕士，主要从事机能实验学和糖尿病发病机制和治疗研究。