黄芪总皂苷对X线诱导的心肌成纤维细胞纤维化损伤的影响

顾 静

(甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000)

·基础研究·

黄芪总皂苷对X线诱导的心肌成纤维细胞纤维化损伤的影响

顾 静

(甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000)

目的观察黄芪总皂苷(AST)对X线照射诱导的心肌成纤维细胞(CFs)纤维化损伤的影响。方法利用小剂量(0.0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 Gy)X线照射CFs，通过MTT检测细胞增殖活性的改变，通过PCR和Western印迹检测转化生长因子(TGF)-β1和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)表达水平。结果1.0 Gy X线照射CFs后48 h作为X线诱导CFs促纤维化损伤的建模条件。AST可剂量依赖性地抑制X线照射CFs产生的活性氧(ROS)，降低Col-Ⅰ和TGF-β1、p-Smad2/3 mRNA和蛋白表达水平。结论AST显著抑制X线诱导的CFs纤维化损伤效应，这种作用可能与其抗ROS作用有关。

放射性纤维化损伤；心肌成纤维细胞；转化生长因子-β1；黄芪总皂苷

放射性心脏疾病(RIHD)是胸部肿瘤放疗后最常见的良性致死原因，其发生率呈上升趋势，但其发病机制不清，临床尚无有效治疗措施。放射性心脏损伤实际上是一个由外而内的渐进性纤维化过程，是心肌胶原合成与降解失衡的结果，主要表现为心肌成纤维细胞(CFs)的增多、心肌胶原合成的增加和胶原成分的改变〔1〕。CFs是心脏纤维化的主要效应细胞，其合成和分泌的转化生长因子(TGF)-β1与TGF-β Ⅰ型受体结合后，刺激受照射组织的上皮增生、CFs增生、细胞外基质大量分泌、胶原沉积和纤维组织形成，参与心肌纤维化的过程〔2〕。现普遍认为氧化应激是放射引起炎症反应和纤维化损伤的主要机制〔3,4〕。因此抗氧化治疗是目前放射性纤维化干预研究热点。黄芪总皂苷(AST)是中药黄芪的主要有效药理成分，临床可用于心血管疾病的干预〔5〕。研究表明AST有明确的抗氧化特性〔6〕，可通过其抗氧化作用有效地抑制肺纤维化〔7〕。本研究主要观察AST对受照射的CFs中纤维化相关分子表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料 大鼠源性CFs，购自江阴齐氏生物科技有限公司。DMEM/F-12 1∶1培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、dNTP mix、Oligo(dT)购自Promega公司，RT2 纤维化 PCR芯片购自QIAGEN公司；PCR引物合成于上海英骏生物技术有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠IgG、大鼠β-actin单克隆抗体、大鼠Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)单克隆抗体、大鼠TGF-β1单克隆抗体、大鼠p-Smad2/3单克隆抗体等购自Santa Cruz公司；Tween-20、苯甲基磺酰氟(PMSF)、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)购自北京索莱宝科技有限公司。AST为我校药理学重点实验室提供。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及X线照射造模 CFs培养体系为含10%胎牛血清、2×103U/L庆大霉素和0.2%CFs生长因子的DMEM/F-12培养液(3 ml培养体系)，置于5%CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每2天换液1次。0.25%胰蛋白酶400 ml，37℃消化，倒置相差显微镜下观察，待细胞变圆后，吸弃胰酶终止消化，并及时加入含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液，吹散制成单细胞悬液并随机分成各实验组和对照组。

细胞照射前12 h，更换新的培养基。细胞照射在省肿瘤医院放疗室(常温下)，用医用直线加速器(德国西门子PRIMUS)低能X射线一次性照射各组细胞，皮源距100 cm，能量6 mV/min，按照预先设定的辐射剂量(0.5，1.0，2.0，3.0,4.0 Gy)完成照射。迅速返回细胞培养间，进行灭菌处理(紫外照射0.5 h，去除封口膜，用75%酒精全面擦拭培养瓶或96孔板)，置于培养箱继续培养，每48 h更换一次培养基。

1.2.2MTT 取对数生长期的同批细胞接种于96孔板中(1×104个/L)培养12 h，用0.0，0.5，1.0,2.0,3.0，4.0 Gy X线照射细胞；然后分别于照射后12、24、48、72 h向每孔加入10 μl MTT(5 g/L)，培养箱中孵育4 h后弃去每孔液体，加入150 μl DMSO，摇床上混匀15～20 min，用酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定吸光度(A)值。MTT还用于受试药物细胞毒性检测和剂量筛选。

1.2.3Western印迹 细胞裂解提取总蛋白，煮沸变性4℃保存；按照普利莱蛋白定量盒说明书进行二喹啉甲酸(BCA)蛋白质定量，以牛血清白蛋白(BSA)标准蛋白562 nm测量吸光度(OD)值对蛋白浓度(mg/L)绘制标准曲线图，得出样本蛋白浓度计算公式并按照公式计算蛋白上样量；制备SDS-PAGE凝胶，加样、恒流电泳分离蛋白；恒压转膜；5%的脱脂奶粉封闭膜上非特异结合的蛋白，加一抗孵育，二抗孵育；曝光显色及图像分析。由 Bio-Rad凝胶成像仪采集信号并摄取凝胶图像，用Quantity One图像分析软件分析目标蛋白与内参灰度值，间接表示目标蛋白相对表达量。

1.2.4RT-PCR 分别取0.0，0.5，1.0，2.0，4.0 Gy X线照射后12，24，48，72 h时点的细胞，用Trizol试剂裂解细胞获得总RNA；应用紫外吸收法测定RNA溶液浓度和纯度，并计算反转录体系加入量；上述RNA样本经反转录后获得cDNA；将事先合成的TGF-β1，Col-Ⅰ和β-actin等引物加入PCR扩增体系；使用Bio-Rad实时检测分析PCR产物。

1.2.5流式细胞术 流式细胞术被用来检测细胞内X线照射产生的活性氧(ROS)水平。CFs中加入0.1 mmol/L的2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)，该物质本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成二氯二氢荧光黄(DCFH)。而 DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的二氯荧光黄(DCF)。Epics XL-4 流式细胞分析仪检测DCF的荧光判断细胞内ROS的水平。

1.3统计学方法 应用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1X线照射CFs建立纤维化损伤细胞模型

2.1.1MTT检测 与0.0 Gy相比，CFs受到3.0、4.0 Gy 12、24、48、72 h细胞增殖率均明显下降(均Plt;0.01)；2.0 Gy照射后这种增殖抑制效应一直到48 h才出现(Plt;0.05)；而更小剂量1.0 Gy照射后增殖抑制出现在72 h(Plt;0.05)，当照射剂量减小至0.5 Gy，在各观察时间点均未发现细胞增殖抑制(Pgt;0.05)，见表1，同时1.0 Gy照射后CFs的形态没有明显改变，见图1。

2.1.2纤维化主要效应分子表达检测 用0.5、1和2 Gy X射线照射CFs后48 h，TGF-β1 mRNA表达明显增加(Plt;0.01，Plt;0.01)；1.0，2.0 Gy组Col-Ⅰ mRNA表达明显增加(Plt;0.01)，0.5 Gy组Col-Ⅰ mRNA表达无明显改变(Pgt;0.05)；4.0 Gy照射后，TGF-β1和Col-Ⅰ mRNA表达均显著降低(Plt;0.01,Plt;0.05)。随着照射剂量的逐渐增加，TGF-β1和Col-Ⅰ蛋白表达也表现为类似的趋势，1.0、2.0 Gy组TGF-β1及Col-Ⅰ明显增高(Plt;0.01)，这种小剂量射线促进纤维化相关分子高表达的效应可被4.0 Gy射线显著抑制，见表2。小剂量X线(1.0和2.0 Gy)有明显的促纤维化效应，而剂量增大(4.0 Gy)这种促纤维化效应被抑制。1.0 Gy和2.0 Gy X射线照射CFs后48 h细胞有明显的促纤维化改变可作为X线诱导CFs纤维化损伤模型的造模条件，由于1.0 Gy的促纤维化效应比2.0 Gy的更显著，故在后续的试验中更多使用1.0 Gy照射细胞构建纤维化损伤模型。

表1 X线照射对CFs 相对增殖率的影响

与0.0 Gy组比较：1)Plt;0.01，2)Plt;0.05，下表同

图1 X射线对CFs形态的影响(×25)

照射剂量TGF-β1mRNACol-ⅠmRNATGF-β1蛋白Col-Ⅰ蛋白0.0Gy1.001.001.001.000.5Gy1.202)1.02--1.0Gy2.391)2.101)2.601)3.001)2.0Gy1.891)1.811)2.001)2.291)4.0Gy0.782)0.601)0.801.01

2.2AST对受照射的CFs增殖影响及最佳浓度筛选 照射前1～2 h用不同浓度(0，10，20，40，80 μg/ml)AST预处理CFs，增殖抑制出现在40 μg/ml和80 μg/ml AST预处理组，与对照组(0 μg/ml AST)相对比，增殖率分别降低到80%和60%(均Plt;0.05)。而10 μg/ml和20 μg/ml AST预处理不会明显影响受照射CFs的增殖率(分别为95%和92%)。因此选择10 μg/ml和20 μg/ml作为后续实验中AST预处理CFs的浓度。

2.3AST预处理对受照射CFs中ROS的影响 CFs在照射之前用AST(0、10、20 μg/ml)预处理2 h后，AST能剂量依赖性地抑制1.0 Gy X线照射的CFs内ROS的产生，与0 μg/ml AST组比较10、20 μg/ml AST处理组ROS分别降低了33.33%和50.00%。

2.4AST预处理对受照射CFs中纤维化标志分子TGF-β1和Col-Ⅰ表达的影响 在X线照射CFs之前，以10、20 μg/ml AST预处理受照射细胞，发现AST显著降低X线诱导的纤维化分子上调表达。与0 μg/ml AST预处理组比较，10、20 μg/ml AST 预处理细胞，Col-Ⅰ mRNA表达分别降低了24.51%和39.22%(均Plt;0.01)；TGF-β1 mRNA表达分别降低了26.51%和 48.12%(均Plt;0.01)。20 μg/ml AST 预处理细胞后，与0 μg/ml AST预处理组比较，Col-Ⅰ蛋白表达降低了64.02%(Plt;0.01)；TGF-β1和p-Smad2/3蛋白表达分别降低了48.14%和38.20%(均Plt;0.01)，表明AST能明显抑制照射引起CFs的促纤维化损伤，在mRNA表达水平上，这种抑制效应似乎还呈现剂量依赖性。见图2。

1～4：0.0 Gy，1.0 Gy，1.0 Gy+AST 20 μg/ml，AST 20 μg/ml图2 AST对受照射CFs中 TGF-β1、p-Smad2/3和Col-Ⅰ蛋白表达的影响

3 讨 论

近年来，大部分RIHD相关研究主要关注的是受照射的实验动物组织病理学观察，本研究结果显示X线照射可显著地降低细胞增殖率，这种抑制增殖的效应有明显的剂量和时间依赖性，低剂量X线不会引起细胞严重损伤，但有直接的促纤维化效应，Herskind等〔8〕研究显示照射能直接诱导成纤维细胞分化为纤维细胞，这种诱导分化作用增加了照射后TGF-β1和胶原的合成，促进纤维化的发生。本研究显示1或2 Gy X线被确认为照射CFs引起纤维化损伤的造模剂量，照射后48 h作为观察时间点，这是因为在这些条件下，CFs增殖活性尚可，同时纤维化分子表达增加最显著。上述造模条件可被Boerma等〔9〕研究支持，其实验报告了大鼠CFs接受2 Gy X线照射后的4～48 h内，成纤维细胞生长因子-2和Col-Ⅰ mRNA显著增高。

本文显示较大X线剂量(4.0 Gy)可能引起CFs严重损伤，导致CFs的活性和功能全面降低，而且也表现为细胞增殖率下降。大剂量射线的损伤强度大，细胞功能紊乱，遗传基因受损严重，修复难以挽救细胞，而走向凋亡、坏死。本研究中较低照射剂量(1.0或2.0 Gy)虽不致细胞受损严重，但是由此引起的促炎和促纤维化效应，是放射所致的各种组织器官纤维化至功能受损的根本原因。可见“小剂量X线的早期损伤效应研究”更符合放疗副反应的发生发展过程，也更接近放射性纤维化的临床防治目的。

器官纤维化是一个多因素相互作用的慢性炎症疾病，表现为细胞外基质过度沉积，这些基质主要由Col-Ⅰ和 Col-Ⅲ构成。分泌基质的肌成纤维细胞被认为是所有纤维化疾病的病理调控中心〔10,11〕。一些器官纤维化的模型研究结果提示靶向干预肌成纤维细胞对纤维化有治疗效果〔12〕。本研究结果说明，AST可抑制受照射CFs合成和分泌细胞外基质，因而具有防治放射诱导的促纤维效应。这一研究结果符合一个早期研究〔13〕。研究显示TGF-β信号通路参与放射性纤维化的发生发展〔14,15〕。这条信号通路的激活起始于TGF-βs结合到丝/苏氨酸蛋白激酶受体复合物上，随后招募并磷酸化细胞内效应器蛋白Smad2/Smad3，磷酸化的Smad2/Smad3结合到Smad4并移位至细胞核内激活基因表达。本实验从蛋白表达水平证明20 μg/ml AST可逆转上述射线对TGF-β1-Smad信号通路的调节，因此具有抑制放射性纤维化的作用。这一研究结果也被黄芪可降低成纤维细胞中TGF-β的表达研究支持〔16〕。AST能抑制丙二醛(MDA)的增加〔17〕，还能提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性〔18〕，因此能减弱氧化应激对心肌的损伤。AST抑制放射促纤维化效应可能与其抑制受照射CFs中的ROS 有密切的关系。这个推测可被先前的研究支持〔19〕，研究报告黄芪通过其抗氧化特性减少炎性细胞因子的释放，进而减弱细胞损伤和炎症反应引起的纤维化损伤。

本研究在细胞水平上观察到小剂量X线照射的促纤维化损伤效应，AST有抗放射性纤维化效应，一方面，这种效应与CFs中胶原表达和TGF-β1-Smad信号通路调节有关，另一方面，这种作用也可能是通过其抗氧化特性实现的。我们在体外实验的研究认为该药有望应用于放射性心脏纤维化损伤的临床防治，但仍需大量实验进一步验证。

1Brilla CG.Renin-angiotensin-aldosterone system and myocardial fibrosis〔J〕.Cardiovasc Res,2000;47(1):1-3.

2Gabbiani G.The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases〔J〕.J Pathol,2003;200(4):500-3.

3Gaya AM,Ashford RF.Cardiac complications of radiation therapy〔J〕.Clin Oncol,2005;17(3):153-9.

4Weintraub NL,Jones WK,Manka D.Understanding radiation-induced vascular disease〔J〕.J Am Coll Cardiol,2010;55(12):1237-9.

5霍根红.黄芪心血管药理作用研究进展〔J〕.河南中医学院学报,2007;22(1):86-7.

6Fang F,Dang R,Feng X，etal.Effect of interferon-g and membranous milkvetch root extract on gene expression of transforming growth factor-b1 and material metalloprotease-2,9 in hyperoxia-induced lung injury〔J〕.J App Clin Pediatr,2007;18(22):138.

7Guan S.Idiopathic pulmonary fibrosis in the oxidative damage and oxidation treatment progress〔J〕.Chin J Postgrad Med,2007;30(7):62-3.

8Herskind C,Bentzen SM,Overgaard J，etal.Differentiation state of skin fibroblast cultures versus risk of subcutaneous fibrosis after radiotherapy〔J〕.Radiother Oncol,1998;47(3):263-9.

9Boerma M,Bart CI,Wondergem J.Effects of ionizing radiation on gene expression in cultured rat heart cells〔J〕.Int J Radiat Biol,2002;78(3):219-25.

10Sandbo N,Dulin N.Actin cytoskeleton in myofibroblast differentiation:ultrastructure defining form and driving function〔J〕.Transl Res,2011;158(4):181-96.

11Gabbian G,Ryan GB,Majne G.Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction〔J〕.Experientia,1971;27(5):549-50.

12Hemmann S,Graf J,Roderfeld M，etal.Expression of MMPs and TIMPs in liver fibrosis-a systematic review with special emphasis on anti-fibrotic strategies〔J〕.J Hepatol,2007;46(5):955-75.

13牟 姗,王 琴,施蓓莉，等. 高糖对肾小管上皮细胞胶原分泌和PAI-1合成的影响以及黄芪调控作用〔J〕.中国中西医结合肾病杂志,2009；10(1):11-4，95.

14Scharpfenecker M,Floot B,Russell NS，etal.Endoglin haploinsufficiency reduces radiation-induced fibrosis and telangiectasia formation in mouse kidneys〔J〕.Radiother Oncol,2009;92(3):484-91.

15Rodemann HP,Binder A,Burger A.The underlying cellular mechanism of fibrosis〔J〕.Kidney Int,1996;54(54):S32-6.

16陈清江,杨 丽,王 辉，等. 黄芪对人肾间质成纤维细胞增殖和转化生长因子-β1表达的影响〔J〕. 郑州大学学报(医学版),2005；(5):871-3.

17熊 平，蒋灵芝，廖秀清. 黄芪甲苷保护大鼠肺缺血再灌注肺损伤的形态学研究〔J〕.南方医科大学学报，2010；30(8):1864-7.

18孙增涛，廉 富，李小娟，等.肺纤维化模型大鼠肺组织中转化生长因子β1及转化生长因子β1 mRNA的表达及黄芪莪术合剂的干预效应〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2007；11(14):2645-7.

19刘永琦，李金田，李 娟，等. 黄芪对肺纤维化大鼠血清细胞因子及肺超微结构的影响〔J〕. 中国免疫学杂志,2008；24(11):980-3.

〔2016-06-16修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

EffectofAstragalosideoncardiacfibroblastsfibrosisdamageinducedbyXray

GUJing.

BasicMedicalCollege,GansuTraditionalChineseMedicineUniversity,Lanzhou730000,Gansu,China

ObjectiveTo observe the effect of Astragaloside (AST) on cardiac fibroblasts (CFs) fibrosis damage induced by X ray.MethodsCFs were radiated by 0.0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0 Gy X gray. MTT was used to detect cell proliferation,PCR and Western blot were used to detect transforming growth factor (TGF)-β1 and Col-Ⅰ expressions.ResultsModel of CFs fibrosis damage induced by X ray was made by 1.0 Gy X ray for 48 h. AST could dose dependently inhibite reactive oxygen species (ROS) produced by CFs damaged by X ray,reduce expressions of Col-Ⅰ,TGF-β1,p-Smads 2/3 mRNA and protein.ConclusionsAST could inhibit CFs fibrosis damage induced by X ray,which might be related with its anti-ROS effect.

Radiation fibrosis damage;Cardiac fibroblasts;Transforming growth factor (TGF)-β1;Astragaloside

R542.2

A

1005-9202(2017)22-5485-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.001

国家自然科学基金(No.81660742)；甘肃省自然科学基金(No.1310RJZA088)；甘肃省中医药管理局(No.GZK-2015-43)

顾 静(1980-)，女，副教授，博士，主要从事心血管药理生理学和循证中医药研究。