三种猪伪狂犬病抗体监测方法的比较

龚文波，徐静，郭建宝，邱文英，张丽燕，秦运杰

（华派生物工程集团有限公司，四川 简阳 641400）

三种猪伪狂犬病抗体监测方法的比较

龚文波，徐静，郭建宝，邱文英，张丽燕，秦运杰

（华派生物工程集团有限公司，四川 简阳 641400）

本试验以伪狂犬病病毒（PRV）Bartha-k61制备灭活疫苗，接种PRV抗体阴性猪，然后用gB ELISA抗体检测法、中和抗体指数法和中和抗体法进行效果监测。结果显示：三种方法都能检测到疫苗接种后发生了免疫应答，但以中和指数值和中和抗体值来表示猪群免疫效果更为准确，gB ELISA抗体阳性率不能作为群体免疫效果指标。

伪狂犬病病毒；gB ELISA；中和抗体；中和指数

猪伪狂犬病是猪的主要疾病之一，给我国养猪业造成了巨大的经济损失，目前常接种gE基因缺失的伪狂犬病疫苗进行控制[1-3]。为了获得最佳的猪伪狂犬病疫苗抗体监测方法，本文对临床常使用的ELISA方法、注册资料中常使用的中和指数法与中和抗体法[4]进行比较，以评判gB ELISA方法是否能用于免疫抗体临床监测。

1 材料

1.1 试剂盒 伪狂犬病gB ELISA抗体检测试剂盒，由美国IDEXX公司生产，批号：DK060。

1.2 细胞 猪睾丸传代细胞购自CTCC，F4由四川省华派生物制药有限公司质管部提供。

1.3 毒种 PRV Bartha-k61 E20由四川省华派生物制药有限公司质管部提供。

1.4 试剂 MEM购自Gibcol公司，批号：1310366；血清购自金源康公司，批号：20130325；28VG由法国赛比克公司生产，批号：T30641。

2 方法

2.1 灭活疫苗的制备

2.1.1 疫苗 将长至单层的ST细胞（T-75）弃营养液，加入20mL无血清MEM，然后接种100μL种毒病毒液，接种后置37℃ 5%CO2条件下每天观察，细胞病变至80%收获，同时取样测病毒含量。

2.1.2 灭活 按体积比加入0.1%的β-丙内酯，4℃灭活24h，每隔4h振摇一次。

2.1.3 病毒含量测定 将病毒液用无血清的MEM做 10 倍系列稀释，取 10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释度，接种长至单层的ST细胞，100μL/孔，每个稀释度接种8孔，置37℃ 5%CO2条件下培养5d，从第3d起观察细胞病变，并计数。按Reed-Munch法计算TCID50。

2.1.4 灭活检验 取长至单层的ST细胞一瓶，弃培养液，加18mL无血清MEM，然后接种2 mL待检样品，置37℃ 5%CO2条件下培养3d，每天观察细胞病变，若无细胞病变，则冻融后再盲传2次，仍无病变，则灭活彻底。

2.1.5 乳化 根据测定的病毒含量结果，将灭活的病毒液稀释成107.5TCID50/mL，将稀释后的灭活病毒液按3份病毒液+1份28VG，以3500r/min乳化20min，然后分装。

2.2 选猪及分组 选择28～35日龄，gB ELISA抗体阴性和伪狂犬病中和抗体≤2的仔猪17头，分别标记。

2.3 疫苗接种及血清采集 将17头阴性猪随机分为2组，疫苗接种组12头，未接种疫苗对照组5头，混合饲养。第1组在试验开始前（PI0）接种伪狂犬病灭活疫苗1 mL/头，在首次接种后14d（PI14）进行第二次接种（1mL/头），对照组接种生理盐水。在首免后14 d（PI14）、21 d（PI21）、28 d（PI28）、35 d（PI35）采集血样，分离血清备用。

2.4 血清ELISA gB抗体检测 按厂家使用说明操作并判定结果。

2.5 中和抗体测定 取50 μL血清，在96孔微量培养板中用不含血清的MEM进行2倍系列稀释，稀释至28，然后将PRV Bartha-k61病毒稀释成2000TCID50/mL，每孔加入稀释好的病毒 50 μL，并设病毒对照、MEM对照，置37℃下作用60min，然后加入细胞悬液100μL，置37℃ 5%CO2培养箱中4～5d，观察细胞病变，以完全抑制细胞病变的血清最高稀释度为该血清的中和抗体效价，中和抗体效价以log2表示。

2.6 中和抗体与ELISA抗体S/N值的比较 分别计算当中和抗体为 0、1、2、3、4、5、6 时 ELISA 抗体 S/N值的几何平均值，并以此作图。

2.7 中和指数测定 将PRV Bartha-k61病毒液进行10-1～10-710倍系列稀释，每个稀释度各取0.5mL，分别加入等量的中和抗体为0的血清，37℃作用1h，然后接种长满单层的ST细胞，每个稀释度接种8孔，接种后37℃培养、观察120h，计算其TCID50。同中和抗体为 0 的血清一样，测中和抗体为 1、2、3、4、5、6的血清与10倍系列稀释的病毒液作用后的TCID50。分别计算中和抗体为0的TCID50与中和抗体为 1、2、3、4、5、6 的 TCID50的比值，即得中和指数[5]。

将不同中和抗体效价的中和指数与不同中和抗体效价的ELISA抗体S/N几何平均值比较，并以此作图。

3 结果

3.1 PI0、PI14、PI21、PI28、PI35 gB ELISA 抗体阳性率、ELISA S/N几何平均值及中和抗体几何平均值 结果见表1。

表1 不同时间段疫苗接种组和阴性对照组的ELISA阳性率、ELISA S/N几何平均值、中和抗体几何平均值

在疫苗接种前，ELISA抗体检测结果都为阴性，中和抗体在0～2之间（数据未显示）。因此将ELISA抗体为阴性、中和抗体不高于2的猪定为阴性猪。在疫苗接种后14～35d，gB ELISA抗体全都为阳性，中和抗体的几何平均值上升到2.62～4.42。ELISA S/N几何平均值从PI0的0.937下降到0.027。未接种疫苗组的gB ELISA抗体全部为阴性，中和抗体平均值在0.2，ELISA S/N几何平均值维持在 0.83～1.08之间。

从以上结果可以看出，ELISA抗体阳性率反映了疫苗接种后的免疫应答，但不能反映不同时间段免疫应答的强度。ELISA抗体S/N几何平均值大小反映了疫苗接种后的免疫应答及免疫应答强度，中和抗体也同样反映了疫苗接种后的免疫应答及免疫应答强度。

3.2 不同中和抗体值测得的中和指数 结果见表2。从表2结果来看，病毒液测出的病毒含量为108.2TCID50/mL，中和抗体为0和1的血清与病毒液中和后测出的病毒含量为107.5TCID50，说明血清本身含有的一些因子对病毒有很低的中和能力。随着中和抗体滴度上升，中和抗体指数也上升。

表2 中和抗体指数法测定结果

从中和抗体与中和指数关系曲线图来看，R2=0.969，表明用这两种方法来监测免疫应答的结果具有很强的相关关系。当中和抗体指数为316时，相交于中和抗体轴的3.3（图1）。

图1 中和抗体与中和指数关系曲线

3.3 中和抗体为 0、1、2、3、4、5、6 时 ELISA 抗体的 S/N几何平均值 结果见表3。

表3 中和抗体与gB ELISA S/N几何平均值的比较

从表3结果来看，中和抗体在0、1时，S/N值差异不显著；中和抗体在2、3时，S/N值差异不显著；中和抗体在4、5、6时S/N值差异不显著。从图2中和抗体与ELISA S/N值的关系曲线来看，二者有较强的相关关系，R2=0.840；中和抗体为3.3时，相交于S/N轴的0.155。从图3的中和指数与ELISA S/N几何平均值的比较来看，二者具有较强的相关关系，R2=0.875；中和抗体指数为316时，相交于S/N轴的0.145。

图2 中和抗体与ELISA S/N值关系曲线

图3 中和指数与ELISA S/N值关系曲线

4 讨论与结论

4.1 gB ELISA是临床监测伪狂犬病免疫效果的主要手段，监测结果常以阳性所占百分比表示，百分率越高，表示保护效果越好。从本研究结果来看，疫苗接种后14d阳性率达到100%，但中和抗体几何平均值为2.62，中和抗体指数在130～140之间（根据作图获得的结果）。据资料报道，中和抗体指数在316时才具有保护作用。因此尽管在接种14d时阳性率达100%，但仍不具有保护作用。故不能以gB ELISA抗体阳性百分率来表示免疫保护效果。

4.2 从中和抗体指数与中和抗体关系的比较来看，二者有很强的相关关系，中和抗体指数在316时，对应的中和抗体为3.3，因此可将中和抗体达到3.3定为具有免疫保护作用。

4.3 从中和抗体指数值、中和抗体值与gB ELISA S/N几何平均值的关系来看，前二者与gB ELISA S/N几何平均值都有较强的相关关系。中和抗体指数在316时，对应的gB ELISA S/N几何平均值为0.14～0.15；中和抗体值在3.3时，对应的gB ELISA S/N几何平均值为0.15～0.16。因此，可将gB ELISA S/N值在0.15左右定为具有免疫保护作用。进行群体免疫效果监测时，不应以ELISA抗体阳性率来判定免疫效果，而应以gB ELISA S/N值在0.15以上作为群体免疫效果的评判依据。

[1] 王川庆，杨霞，陈陆.4株猪伪狂犬病病毒gE基因的克隆与序列分析[A]∥中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集[C].2009.

[2]杨毅，李文刚，饶宝，等.猪伪狂犬病疫苗的研究进展[J].江西农业学报，2010（3）：154-157.

[3] Yu X，Zhou Z，Hu D，et al.Pathogenic pseudorabies virus China，2012[J].Emerging Infectious Diseases，2014，20（1）：102-104.

[4] 邹浩勇，陈冬焕，熊金凤，等.伪狂犬病毒中和抗体与gB-ELISA抗体阻断率之间的相关性[J].猪业科学，2008（5）：94-96.

[5] 舒银辉，黄文辉，饶清宜，等.猪伪狂犬病灭活疫苗（HB-J株）对兔与猪免疫攻毒保护平行关系研究[J].中国兽药杂志，2014，46（10）：5-8.

Comparison of Three Methods for the Monitoring of Porcine Pseudorabies antibody

Gong Wenbo，Xu Jing，Guo Jianbao，et al.
（Huapai Bioengineering Group Co.′Ltd.′Sichuan Jianyang 641400，China）

Pseudorabies virus（PRV） antibody negative pigs were inoculated with the inactivated vaccine prepared by PRV Bartha-k61 strain，and then the immunizing efficiency of the vaccine was evaluated by gB ELISA antibody assay，neutralizing antibody index method and neutralizing antibody method.The results showed that the three methods could detect the immune response after vaccination，compared with the positive rates of gB ELISA antibody，the neutralizing index values and the neutralizing antibody values were more accurate to measure the immune effect of the vaccine in pigs，so it could not be used as an indicator for the evaluation of herd immunity effect.

Pseudorabies virus；gB ELISA；Neutralizing antibody；Neutralizing index

S854.43

B

1001-8964（2017）11-0025-04

2017-08-17

龚文波（1965-），男，重庆垫江人，硕士研究生，高级工程师，华派生物工程集团有限公司总经理，主要从事兽用生物制品的研发及生产管理。