大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统改造对产L-色氨酸的影响

吴涛，赵津津，毛贤军



大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统改造对产L-色氨酸的影响

吴涛，赵津津，毛贤军

梅花生物科技集团股份有限公司廊坊梅花生物技术开发有限公司，河北廊坊 065001

吴涛，赵津津，毛贤军. 大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统改造对产L-色氨酸的影响. 生物工程学报, 2017, 33(11): 1877–1882.Wu T, Zhao JJ, Mao XJ. Effect of PTS modifications on L-tryptophan production in Escherichia coli. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1877–1882.

L-色氨酸是芳香族氨基酸的一种，被广泛应用于医药、食品和饲料等领域。大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统 (PTS系统) 在葡萄糖转运和磷酸化过程中起重要作用，是糖代谢基因表达调控的核心。利用Red同源重组系统，构建包含两类典型PTS系统突变 (-+和-) 的L-色氨酸生产菌，并对相关菌株进行补料分批发酵研究。结果表明，不同类型PTS系统突变对菌体生长、L-色氨酸产量、糖酸转化率及副产物生成均有较大影响。与出发菌相比，-+突变株最高600达到125，提高47.0%，产酸38.5 g/L，提高25.9%，糖酸转化率16.7%，提高26.5%，乙酸生成略有增加；-突变株最高600达到100，提高17.6%，产酸33.4 g/L，提高9.4%，糖酸转化率15.5%，提高17.4%，乙酸生成略有减少。对葡萄糖转运系统的进一步研究将为大肠杆菌合成L-色氨酸效率的提升提供帮助。

大肠杆菌，L-色氨酸，PTS系统，补料分批发酵

L-色氨酸是芳香族必需氨基酸的一种，被广泛应用于饲料、医药和食品等领域。目前L-色氨酸的合成效率偏低，高昂的价格严重限制了其应用规模。提高L-色氨酸的生物合成效率、降低生产成本具有重要的应用价值。L-色氨酸生物合成途径复杂，前体来源于糖酵解途径、磷酸戊糖途径及三羧酸循环等多个基础代谢途径。每合成1 mol L-色氨酸需要 1 mol磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 和1 mol 4-磷酸赤藓糖 (E4P) 作为起始前体，另外还需分别消耗PEP、谷氨酰胺、5-磷酸核糖焦磷酸 (PRPP) 和丝氨酸各 1 mol[1]。因此，研究色氨酸合成代谢对研究微生物代谢平衡具有重要的科学意义。

1979年，Tribe等[2]利用DNA重组技术首次将基因引入大肠杆菌，L-色氨酸产量达到1 g/L。此后，随着代谢工程改造的深入和发酵工艺的优化，利用重组大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌发酵生产L-色氨酸的效率得到了数十倍的提升[3–7]。1996年，Berry[3]在大肠杆菌中高表达去除反馈抑制 (Feed-back resistance，fbr) 的fbr、fbr基因，发酵52 h产L-色氨酸近45 g/L，过程最高糖酸转化率约为22%。1999年，Ikeda等[4]在产L-色氨酸的谷氨酸棒杆菌pIK9960中高表达基因，增加L-色氨酸合成前体E4P的水平，从而提高L-色氨酸的合成效率，发酵80 h的L-色氨酸产量达到58 g/L。2012年，Cheng等[7]通过对产L-色氨酸大肠杆菌TRJH的发酵补料策略优化，发酵40 h左右，产量达到38.8 g/L，糖酸转化率高达19.9%。

大肠杆菌可通过多种途径转运并磷酸化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖，然后将其导入糖酵解途径。野生型大肠杆菌利用磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(简称PTS系统) 转运并磷酸化葡萄糖。PTS系统由EⅠ、HPr和EⅡs构成，EⅠ、HPr分别由、基因编码，为胞质可溶性蛋白；EⅡs包括EⅡMan、EⅡFru、EⅡBgl、EⅡAGlc、EⅡCBGlc等，多为蛋白复合体，对碳水化合物具有特异性，其中EⅡAGlc、EⅡCBGlc分别由、基因编码[8-9]。PTS系统转运1 mol葡萄糖需消耗1 mol PEP[9-10]。当大肠杆菌在以葡萄糖为碳源的限制性培养基中生长时，PTS系统消耗了约50%的PEP用于葡萄糖的转运和磷酸化[11]，直接影响以PEP为前体的化合物 (如莽草酸、芳香族氨基酸、天冬氨酸族氨基酸等) 的合成。在PTS系统缺陷大肠杆菌中，葡萄糖可以通过半乳糖/氢离子协同转运蛋白 (D-Galactose/H+symporter，GalP) 和葡萄糖激酶 (Glucokinase，Glk)协同作用进入胞内[9-11]，以ATP为磷酸基团供体，但以GalP、Glk协同作用磷酸化转运葡萄糖的效率较低[11]。另外，大肠杆菌也可通过引入外源高效的葡萄糖转运磷酸化系统，如运动假单胞菌来源的、基因，分别编码葡萄糖转运蛋白 (Glucose facilitator，Glf) 和葡萄糖激酶 (Glk)，以ATP为磷酸基团供体，转运并磷酸化葡萄糖[11-12]。

PTS系统改造的大肠杆菌被广泛应用于多种化合物的发酵生产，如莽草酸、苯丙氨酸、乙醇等[11-12]。对于PTS系统的修饰改造可分为3类：-、PTS-Glc+(-突变菌经进化获得可在葡萄糖为碳源的限制性培养基上生长的Glc+表型) 和PTS-+(-突变菌通过表达外源、基因获得Glc+表型)[11]。本研究采用Red同源重组系统，构建了两类典型的PTS系统突变体-+和-，将其应用于产L-色氨酸生产菌的构建，PTS系统突变后，葡萄糖转运将不再消耗PEP，胞内色氨酸重要前体物PEP的水平提高1倍，色氨酸生产能力有望显著提高。本研究还对不同PTS系统改造菌株的生产性能进行了补料分批发酵初步研究，首次综合评价了不同类型PTS系统改造对大肠杆菌产L-色氨酸的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

本研究使用的菌株和质粒见表1。产L-色氨酸大肠杆菌MA01为出发菌，公开保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 6863，根据专利WO8701130A1[13]及Mascarenhas等[14]描述的方法构建，其宿主菌SA01为K-12 CICC 10303衍生的K-12 CICC 10303 ∆∆，所含质粒pMG43为pBR322来源，包含有、fbr和fbr基因。

表1 本研究使用的菌株和质粒

1.2 培养基

种子培养基：20 g/L葡萄糖，15 g/L酵母浸粉，10 g/L (NH4)2SO4，0.5 g/L柠檬酸钠，5 g/L MgSO4·7H2O，1.5 g/L KH2PO4，15 mg/L FeSO4·7H2O，1.2 mg/L VB1，pH 7.0。

发酵培养基：10 g/L葡萄糖，1 g/L酵母浸粉，4 g/L (NH4)2SO4，2 g/L柠檬酸钠，5 g/L MgSO4·7H2O，2 g/L KH2PO4，0.1 g/L FeSO4·7H2O，6.3 mg/L MnSO4·H2O，7.4 mg/L ZnSO4·H2O，5.6 mg/L CoCl2·6H2O，0.8 mg/L CuSO4·5H2O，pH 7.0。

1.3 主要试剂

Phusion®High-Fidelity DNA聚合酶购于NEB公司，限制性内切酶和T4 DNA连接酶购于Fermentas公司，质粒提取试剂盒和DNA回收试剂盒购于Tiangen公司，L-色氨酸、有机酸标准品购于Sigma-Aldrich公司。其他化学试剂均为国产或进口分析纯。

1.4 质粒载体构建

采用常规分子克隆技术[17]，如PCR扩增、酶切、连接和转化等构建重组质粒pMG56，具体方法如下，所用引物序列见表2。

1.4.1 质粒载体pET28-glfglk的构建

以质粒pSC6.090B为模板，用引物glfglk1和 glfglk2扩增约2.3 kb的FK1片段，用引物glfglk3和glfglk4扩增约1.0 kb的FK2片段。以FK1和FK2为模板，用引物glfglk1和glfglk4扩增约3.3 kb的DNA片段，产物用Ⅰ、Ⅰ双酶切，与经同样酶切的质粒pET28a连接，产物转化Top10感受态细胞，转化子用glfglk1和glfglk4为引物PCR鉴定，阳性约3.3 kb。提取重组质粒，用Ⅰ、Ⅰ双酶切鉴定，所得重组质粒pET28-glfglk约8.3 kb。

1.4.2 重组质粒pMG56的构建

质粒pET28-glfglk用Ⅰ、Ⅰ双酶切，回收约3.3 kb的DNA片段，与经同样酶切的质粒pMG43连接，产物转化Top10感受态细胞，转化子用glfglk1和glfglk4为引物PCR鉴定，阳性约3.3 kb。提取重组质粒，用Ⅰ、Ⅰ双酶切鉴定，所得重组质粒pMG56约15.8 kb。

1.5 突变菌的构建

采用Datsenko KA等[15]所述的Red同源重组方法构建突变菌株，具体方法如下。

1.5.1基因敲除菌的构建

以质粒pKD4为模板，pts1和pts2为引物，PCR扩增约1.5 kb的突变基因，电击转化100 μL含有质粒pKD46的SA01感受态细胞，30 ℃孵育 1–2 h，涂布含卡那霉素(25 μg/mL)的LB平板，30 ℃静置培养24 h，挑单克隆以pts3和pts4为引物菌落PCR鉴定，阳性约1.5 kb，所得菌株即为基因的突变菌株SA01 ∆::。

表2 本研究使用的引物

The coding region are underlined, the restriction sites are indicated by bold letters.

将质粒pCP20电击转化菌株SA01 ∆::，菌液涂布含氯霉素(25 μg/mL)的LB平板，30 ℃静置培养24 h。得到的单菌落转接无抗LB平板，42 ℃静置培养12 h，以pts3和pts6为引物进行菌落PCR鉴定，阳性约0.5 kb，所得菌株即为基因敲除的重组菌株SA01-。

1.5.2基因敲除菌的构建

与基因敲除菌的构建方法相同。

1.6 培养条件

摇瓶培养：从冻存管取菌种在LB平板上划线，37 ℃培养24 h；将菌体接种至装有20 mL发酵培养基的500 mL摇瓶中，37 ℃、240 r/min振荡培养48 h。

发酵培养：将过夜培养的菌液接种至50 mL种子培养基中，37 ℃、240 r/min振荡培养5–10 h，600控制在6–8；将菌液转接至装有10 L种子培养基的 20 L发酵罐，36 ℃培养9–18 h，600控制在13–18，溶氧控制在30%以上，pH控制在6.8–7.0；取2.2 L菌液转接至装有20 L发酵培养基的50 L发酵罐，35 ℃培养40–45 h，溶氧控制在10%–20%，转速200– 800 r/min，罐压0.05–0.10 MPa，pH 6.5–6.6，待初 糖耗尽后，流加60% (/) 葡萄糖，流加糖速率为3–17 g/(L·h)。

1.7 葡萄糖、L-色氨酸及其他有机酸含量的测定

取1 mL发酵液，12 000 r/min离心3 min，测定上清液中葡萄糖、L-色氨酸及有机酸的含量。葡萄糖采用SBA-40C生物传感分析仪 (山东省科学院) 进行测定。L-色氨酸及有机酸分别采用HPLC法进行测定[18–19]。

2 结果与分析

2.1 L-色氨酸生产菌的构建

按1.4所述方法，构建重组质粒pMG56。按1.5所述方法，分别构建了缺失突变株SA09和缺失突变株SA29。以SA09为宿主转化质粒pMG43或pMG56，分别构建了L-色氨酸生产菌MA10和MA103；以SA29为宿主转化质粒pMG43，构建了L-色氨酸生产菌MA209。

2.2 PTS系统改造对L-色氨酸生产菌生长的影响

MA01、MA10 (-)、MA103(-+) 、MA209 (-) 按1.6所述的方法进行摇瓶培养，每2 h取样，测定生长曲线 (图1)，重复实验3次。与出发菌MA01相比，缺失突变株MA10葡萄糖摄入能力差，生长缓慢；在MA10内引入、基因，获得的菌株MA103生长旺盛，最高600值达到16.9，较MA01提高了35.6%；缺失突变株MA209，延滞期较出发菌MA01延长近4 h，但最终600值仍达到14.8，较MA01提高19.4%。

2.3 PTS系统改造对L-色氨酸生产菌发酵性能的影响

MA01、MA103和MA209按1.6所述的方法进行发酵培养，测定各菌株的生长曲线，发酵液中葡萄糖、L-色氨酸及其他有机酸含量的变化，最终产酸及糖酸转化率 (图2)。发酵过程采用葡萄糖限制补料分批发酵工艺，控制发酵液中葡萄糖浓度接近 0 g/L，见图2A。缺陷株MA103最高600值达到125，较出发菌MA01提高47.0%；缺陷株MA209虽然前期生长稍慢，最高600值也能达到100，较出发菌MA01提高17.6%，但32 h后600值有明显下降的趋势。

L-色氨酸合成过程及最终产酸、糖酸转化率如图2B和2D所示，与出发菌MA01相比，缺陷株MA103能够达到的最高产酸为38.5 g/L，提高25.9%，糖酸转化率为16.7%，提高26.5%；缺陷株MA209最高产酸为33.4 g/L，提高9.4%，糖酸转化率为15.5%，提高17.4%。

发酵液中的有机酸副产物，如乙酸、甲酸、乳酸、丙酮酸、柠檬酸、莽草酸的含量也进行了测定。结果表明，乙酸含量差别最大，变化趋势也最明显，如图2C所示。缺陷株MA103最高乙酸含量是MA01的2.1倍，达到4.1 g/L，而缺陷株MA209的乙酸含量较MA01低，最高值仅为1.5 g/L。其他有机酸含量偏低，且无显著变化。

图1 PTS系统改造L-色氨酸生产菌生长曲线

图2 PTS系统改造L-色氨酸生产菌的发酵性能

3 讨论

当大肠杆菌在以葡萄糖为碳源的限制性培养基中生长时，PTS系统消耗了约50%的PEP用于葡萄糖的转运和磷酸化，而用于合成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸 (DAHP) 的PEP仅占3%[12,20]，因此将PTS系统替换成利用ATP进行磷酸化的葡萄糖转运系统，对以PEP为前体的芳香族化合物的生物合成具有重要的应用价值。

然而大肠杆菌PTS系统与碳代谢总体调控蛋白CRP-cAMP紧密关联。腺苷酸环化酶环化ATP生成cAMP，其活性受磷酸化的EⅡAGlc(由基因编码)激活，因此不同类型的PTS系统改造会直接影响胞内cAMP的含量。一般认为-突变体因缺失基因，cAMP含量较低，而-突变体因含有磷酸化的EⅡAGlc，cAMP含量较高[9,12]。在RegulonDB和EcoCyc数据库(http://regulondb.ccg.unam.mx/ index.jsp和http://biocyc.org/ecocyc/index.shtml) 中，除糖(阿拉伯糖、木糖、乳糖等) 代谢相关基因外，还有131个“简单”或“复杂”的转录单元被CRP-cAMP激活、抑制或双重调控。这些调控单元与TCA循环、呼吸、渗透压调节、压力响应、生物膜形成、毒力、氮代谢、铁的吸收、感受态能力、多种药物抗性、非编码RNA等相关[12]。因此，不同类型PTS系统突变对于不同化合物生物合成的影响可能存在显著的差异。

本研究首次综合评价了不同类型PTS系统改造对于大肠杆菌产L-色氨酸的影响。结果表明，不同类型PTS系统突变对菌体生长、L-色氨酸产量、糖酸转化率及副产物生成均有较大影响，且表型存在较大差异。MA103 (-+) 在发酵罐中的最高600值能达到120以上，对高密度发酵产L-色氨酸非常有利，最高产酸达38.5 g/L。但发酵液中乙酸含量也相对偏高，达到4.1 g/L，这可能与引入的外源基因、的表达强度有关，调整合适的、基因表达水平，将有望降低乙酸的水平，得到L-色氨酸产量更高的重组菌株。或者通过优化发酵补料策略，降低乙酸水平[7, 21-22]。

MA209 (-) 因PTS系统被阻断，PEP不再作为葡萄糖磷酸化的磷酸供体[8-9]，葡萄糖通过半乳糖/氢离子协同转运蛋白 (GalP) 和葡萄糖激酶(Glk) 协同作用进入胞内[9-11]，以ATP为磷酸基团供体，但以GalP、Glk协同作用磷酸化转运葡萄糖的效率较低[11]，故MA209菌的葡萄糖摄入系统较弱，延滞期较出发菌MA01偏长，进入对数中后期，蛋白表达系统已经建立，比生长速率和糖耗速率与MA01菌接近。但MA209菌的葡萄糖摄入水平较弱，不易积累乙酸，有利于发酵控制。通过增大接种量或优化培养基配方等手段可进一步缩短延滞期时长，获得更高的L-色氨酸产酸和糖酸转化率。另外，与MA103菌相比，MA209菌需激活自身另一套转运葡萄糖系统，涉及复杂的代谢调控，代谢调控过程中浪费较多的碳骨架和能量，故而生长速率、转化效率都会受到影响。

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(本文责编 郝丽芳)

Effect of PTS modifications on L-tryptophan production in

Tao Wu, Jinjin Zhao, and Xianjun Mao

Meihua Biotech (Langfang) Co., Ltd., Meihua Holdings Group, Langfang 065001, Hebei, China

L-tryptophan, one of the aromatic amino acids, is widely used in the fields of medicine, food and feed additives. The phosphoenolpyruvate-carbohydrate phosphotransferase system (PTS) plays an important role in glucose transport and phosphorylation in. PTS-mediated regulation dominates the carbohydrates’ uptake and metabolism in. We constructed L-tryptophan-producing bacteria containing two typical PTS mutations (-+and-) by Red homologous recombination system, and studied in 50 L jar fermenter using fed-batch fermentation. Both PTS system mutants had a great impact on the biomass (increasing 47.0% and 17.6%, respectively), L-tryptophan production (increasing 25.9% and 9.4%, respectively), glucose conversion rate (increasing 26.5% and 17.4%, respectively) and byproduct acetic acid generation (slightly increased and decreased，respectively).

, L-tryptophan, phosphotransferase system, fed-batch fermentation

November 28, 2016;

July 21, 2017

Jinjin Zhao. Tel: +86-316-2359999; E-mail: Zhaojinjin@meihuagrp.com

2017-11-07

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20171107.1128.001.html