呋咱氮氧化薯蓣皂苷元拼合物的合成及其抗肿瘤活性研究

肖敏捷,刘永谦,梁家荣,邱 翔,雷桥良,招仲恒,王 涛*

（1.佛山市妇幼保健院a.药剂科;b.产二科，广东 佛山 528000;2.广东省妇幼保健院 药学部,广东 广州510010;3.广州中医药大学 中药学院,广东 广州 510006）

呋咱氮氧化薯蓣皂苷元拼合物的合成及其抗肿瘤活性研究

肖敏捷1a,刘永谦2,梁家荣3,邱 翔3,雷桥良1b,招仲恒3,王 涛3*

（1.佛山市妇幼保健院a.药剂科;b.产二科，广东 佛山 528000;2.广东省妇幼保健院 药学部,广东 广州510010;3.广州中医药大学 中药学院,广东 广州 510006）

目的：合成强生物活性的薯蓣皂苷元衍生物并探讨其体外抗肿瘤活性。方法：实验通过环加成、缩合、氧化等反应，设计薯蓣皂苷元与呋咱氮氧化物类一氧化氮供体拼合得到目标化合物。并采用噻唑蓝（MTT）法考察目标化合物对HT-29、HepG-2、MCF-7等3种肿瘤细胞株的体外细胞毒性。结果：实验合成了6个新的呋咱氮氧化薯蓣皂苷元拼合物，其结构均经IR、1H NMR和、13C NMR等确证。同时MTT实验结果表明，所合成目标化合物对HT-29、Hepg-2、MCF-7 3种肿瘤细胞均无明显细胞毒性。结论：实验设计的呋咱氮氧化薯蓣皂苷元拼合物合成路径可行，但化合物的无明显抗肿瘤活性，推测化合物NO释放呈低浓度释放，而低浓度NO释放表现为抑制细胞凋亡。

薯蓣皂苷元拼合物；合成；NO供体；抗肿瘤活性

薯蓣皂苷元（Diosgenin，Dio）作为一种天然甾体化合物，早期主要用于合成甾体激素类药物。但随着研究的深入，其抗肿瘤作用也日益受到广大学者的关注。有研究表明，Dio参与癌细胞发展的多个生物学过程从而发挥抗肿瘤作用[1]，且作用效果呈明显的剂量依赖性，并可通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达和增加促凋亡蛋白半胱天冬酶-3（caspase-3）来诱导细胞凋亡[2，3]。也可促进巨噬细胞内NO的分泌，改善特异性和非特异性细胞免疫反应、抑制survivin基因表达、抑制人胃低分化粘液腺癌MGC-803细胞的DNA合成以及人骨肉瘤U-2OS细胞MMP-9/TIMP-1 RNA的表达从而改善免疫系统发挥抗肿瘤作用[4-6]。

NO是具有高度反应性的小分子自由基，在细胞调控和超氧化介导细胞毒性中发挥重要作用。且高浓度的NO是化合物对肿瘤细胞产生细胞毒性的必备条件。Melissa等人发现，NO可通过影响细胞线粒体膜的通透性以及调控细胞色素C氧化酶产生毒性作用[7]。

而在已知的多种NO供体中，呋咱氮氧化物由于具有释放NO更持久、更好的稳定性、且不产生耐受的优越性，在抗肿瘤新药的研发中越来越受到重视[8]。目前，普遍认为其在巯基共同作用下释放出NO从而发挥生物活性，而硝酸酯NO释放则需要在酶激活下才能产生[9]。因此，实验设计将薯蓣皂苷元与呋咱氮氧化合物进行拼接，期望合成出具有高活性的新型抗肿瘤化合物。

1 合成路线

方法[10]，采用不同取代基的烯醛为原料环合，并经琼斯试剂氧化得到呋咱氮氧化合物NO供体片段。将Dio母核上的3位羟基酯化，引入卤代酯片段，最后将Dio卤代酯与呋咱氮氧化合物进行拼合得到目标化合物。见图1。

图1 呋咱氮氧化薯蓣皂苷元拼合物的合成路线Fig.1 Synthesis route of diosgenin complex

1 方法与结果

1.1 仪器与试剂

超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪，Bruker AVANCE AV 400（美国Bruker公司）；X-4数字显示显微熔点测定仪（北京泰克仪器有限公司）；DF-1型集热式磁力搅拌器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；L535R台式冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；SW-CJ-2FD超净工作台（江苏苏净安泰公司）；MCO-20AIC型培养箱（日本SANYO公司）；光学倒置显微镜（重庆市奥利巴斯公司）；Multiskan FC酶标仪（美国Themo公司）。

薯蓣皂苷元（纯度98%，南通飞宇生物科技有限公司）；反式-2-戊烯醛、反式-2-己烯醛（纯度99%，赛默飞世尔科技有限公司）；MTT（噻唑蓝，sigma M2128，sigma公司）；顺铂（注射用，齐鲁制药有限公司）；其余试剂、溶剂均为分析纯。

人-肝癌细胞HepG-2、人 -结肠癌细胞HT-29、人-乳腺癌细胞MCF-7（中科院上海细胞库）。

2.2 制备方法

2.2.12 -[（3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]乙酸薯蓣皂苷元酯的合成

2.2.1.1 3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-甲醛（b1）的合成 在氮气保护下，50mL二颈瓶中加入1mL（10.2mmol） 反式 -2- 戊烯醛、2mL（35.5mmol）HAC，且在冰浴下搅拌5min后缓慢滴加2g（29.5mmol）NaNO2的饱和水溶液，0.5h内滴完。滴加过程中保持冰浴，持续充氮气反应3h。反应结束后，加入15mL饱和食盐水，用乙醚（20mL×3）萃取，合并有机层。减压浓缩后得淡黄液体1.28g，产率88.37%。

2.2.1.2 3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-甲酸（c1）的合成 将 1g（7.0mmol）化合物（A）用 20mL丙酮溶解于50mL二颈瓶中，冰浴搅拌下滴加新配制的Jones试剂（0.7g的CrO3溶于0.6mL浓H2SO4中，加H2O1.9mL稀释即得）。滴加完毕后，升至室温反应，TCL监控反应，反应4h。反应结束后，加入15mL甲醇淬灭反应，继续搅拌5min。减压蒸干溶剂后，残留物中加入20mL饱和食盐水，用乙醚（20mL×3）萃取，合并有机层。有机层用20mL水洗涤后，无水MgSO4干燥过夜。过滤有机层，减压蒸干溶剂，得黄色液体0.95g，产率：85.89%。

2.2.1.3 3-O-溴乙酰-薯蓣皂苷元酯（e1）的合成称取2g（4.8mmol）薯蓣皂苷元置于250mL三颈瓶

中，加入50mL二氯甲烷使其溶解，加入0.04g（0.3mmol）DMAP作催化剂，冰浴搅拌下滴加1mL（11.5mmol）溴乙酰溴。滴加完后，继续冰浴搅拌30min，升至室温下反应，TLC监控反应，反应3h。反应结束后，加入饱和NaHCO3水溶液调pH至中性，二氯甲烷（20mL×3）萃取，合并有机层，有机层用20mL洗涤后，加入无水MgSO4干燥过夜。过滤有机层，减压蒸干溶剂，200-300目硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯（50∶1，V/V）洗脱得到白色固体 0.95 g，收率35.91%，m.p.196～198℃。

2.2.1.42 -[（3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]乙酸薯蓣皂苷元酯（f1）的合成 称取0.9g（1.5mmol）化合物（C）和 1g（6mmol）化合物（B）置于50mL二颈瓶中，用20mL DMF溶解，加入0.1g（0.72mmol）无水碳酸钾为催化剂，100℃回流搅拌反应3h，TLC监控反应（石油醚：乙酸乙酯=50∶1，V/V）。反应结束后，待反应液冷却至室温，反应液中加入30mL蒸馏水，乙醚（20mL×4）萃取，合并有机层。有机层用20mL蒸馏水洗涤后，无水硫酸镁干燥过夜。过滤有机层，减压蒸干溶剂，200-300目硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯（50∶1，V/V）洗脱。得到白色固体0.41g，收率43.52%，m.p.155-156℃。

2.2.22 -[（3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]-丙酸薯蓣皂苷元酯（f2）、2-[（3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]-异丁酸薯蓣皂苷元酯（f3）、2-[（3-丙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]-乙酸薯蓣皂苷元酯（f4）、2-[（3-丙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]-丙酸薯蓣皂苷元酯（f5）、2-[（3-丙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-）甲酰氧基]丙酸薯蓣皂苷元酯（f6）均参照化合物f1的制备方法进行合成，其氢谱及碳谱解析见表1、2。

表1 薯蓣皂苷员呋咱氮氧拼合物氢谱数据Tab.1 1H NMR data of of diosgenin complex

表2 目标化合物13C NMR数据Tab.2 13C NMR data of of diosgenin complex

2.3 MTT法测定目标化合物的体外抗肿瘤活性

分别取生长期的人肝癌细胞HepG-2、人结肠癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞MCF-7于96孔细胞板培养12h后进行试验。实验分别设立药物组、溶剂组、空白组以及阳性对照组（顺铂），其中药物组中每药设立 7个不同浓度组，分别为 60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375μmol·L-1。药物作用 48h 后，在培养板中加入0.5%MTT溶液，每孔10μL，继续置培养箱中培养4h。除去上层液，并加入150μL二甲基亚砜溶解蓝紫色结晶。常温下置微型振荡器振摇10min，酶标仪检测器在570nm波长处测定各孔吸光值，即OD值。由以下公式计算出目标化合物对三种癌细胞的增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=[1-（给药组平均OD值-空白组平均OD值）/（溶剂组平均OD值-空白组平均OD值）]×100%，并根据各浓度组的抑制率，求出各组作用48h后的IC50值。实验结果表示，采用GraphPad Prisim 4.0软件处理结果。并采用单因素方差检验进行统计学分析。结果见表3：可见，实验组与阴性组比较，并无明显统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组化合物作用于人HepG-2、MCF-7、HT-29细胞的IC50值Tab.3 Each group of compounds acted on the IC50values of human HepG-2,MCF-7 and HT-29 cells

体外抗肿瘤活性筛选结果表明，目标产物对人肝癌细胞HepG-2、人结肠癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞MCF-7 3种细胞的增殖抑制不明显，推测目标产物具有持续释放低浓度NO特性，而持续低浓度的NO可抑制细胞凋亡，对细胞具有保护和促进生长的作用；该化合物体外NO释放规律值得进一步研究。

2.4 讨论

烯醛环合的反应中，采用乙酸作溶剂，反应进行比较彻底，副产物较少，但使用的两种烯醛原料在空气中易氧化，因此，操作需在氮气保护下进行。3-乙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-甲醛及3-丙基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-甲醛结构中有双键及醛基，可采用多种催化剂，如活性MnO2、醋酸铜－醋酸锰等[11]，而本实验中则尝试着使用了琼斯试剂，结果显示，该方法可行的，且具有反应时间短、产率较高的特点。在将呋咱氮氧化物与薯蓣皂苷元母体相连的反应中，2－溴丙酰溴和2-溴异丁酰溴由于支链较多，产生较大的空间阻碍，导致目标产物的产率较低。

而从MTT实验结果可知，目标产物对3种人源肿瘤细胞体外抑制活性不强，所有浓度组的抑制率均低于顺铂组，推测化合物NO释放呈低浓度释放，而低浓度NO释放表现为抑制细胞凋亡。

3 结论

本实验设计的合成路径简单可行，成功合成了6个新的呋咱氮氧化薯蓣皂苷元拼合物，可为NO供体薯蓣皂苷元的设计提供新思路。而体外抗肿瘤活性筛选亦表明，化合物NO释放量或呈低浓度释放，可为薯蓣皂苷元类抗肿瘤新药的深入研究奠定基础。

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Study on the synthesis and antitumor activity of diosgenin complex

XIAO Min-jie1a,LIU Yong-qian2,LIANG Jia-rong3,QIU Xiang3,LEI Qiao-liang1b,ZHAO Zhong-heng3,WANG Tao3,*
（1.a.Faculty of pharmaceutical sciences ；b.The Second of Obstrics Departmen，Foshan Women and Children Hospital，Foshan 528000,China；2.Faculty of pharmaceutical sciences of Guangdong Provincial Maternal and Child Health Hospital,Guangzhou 510010，China；3.School of Chinese Materia Medica,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006，China）

To synthesize a novel diosgenin derivative of nitric oxide and to investigate its antitumor activity in vitro.Methods:Diosgenin was designed to combine with nitric oxide donor of nitric oxide through the cycloaddition,condensation and oxidation reactions,to obtain the target compound.The cytotoxicity on cells of HT-29,HepG-2 and MCF-7,was evaluated by MTT.Results:The 6 new combinations of diosgenin were synthesized,and their structures were confirmed by IR,1H NMR and13C NMR.At the same time,MTT experiments showed that the target compounds were not obviously cytotoxic to HT-29,HepG2,MCF-7 cells.Conclusion:The synthetic route of the experiment is feasible,but there is no obvious anti-tumor activity of the new compound.It is speculated that the release of NO is low concentration,while the low concentration of NO release inhibits apoptosis.

diosgenin combination；Synthesis；NO donor；antitumor activity

R914

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171171

2017-09-15

肖敏捷（1990-），女，药师，2016年毕业于广州中医药大学药物化学专业，硕士研究生，佛山市妇幼保健院药剂科，研究方向：天然化合物的结构修饰及活性研究；医院药事管理。

王 涛（1970-），女，教授，广州中医药大学中药学院，研究方向：天然化合物的结构修饰及活性研究。