黄秋葵对糖尿病小鼠的降血糖作用

冯冠英，宋晓雪，徐志立，栾泽柱，张明波 （辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

黄秋葵对糖尿病小鼠的降血糖作用

冯冠英，宋晓雪，徐志立，栾泽柱，张明波 （辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

目的：探究黄秋葵水提液对糖尿病小鼠的治疗作用及作用机制．方法：用四氧嘧啶进行糖尿病小鼠造模；用黄秋葵水提物对糖尿病小鼠进行灌胃，考察糖尿病小鼠的血糖变化．利用分子对接方法，考察黄秋葵所含成分对α-葡萄糖苷酶的抑制作用．结果：黄秋葵水提液能够降低糖尿病小鼠的血糖（P≤0．01），并呈一定剂量依赖性．黄秋葵中所含甾醇类成分可与α-葡萄糖苷酶稳定结合，其中有5个化合物与α-葡萄糖苷酶结合自由能在-9．9 kcal／mol以下．结论：黄秋葵水提液能够有效降低糖尿病小鼠的血糖，其作用机制可能是其中所含的甾醇类成分抑制α-葡萄糖苷酶的活性．

黄秋葵；糖尿病；水提物；降糖作用

0 引言

黄秋葵（Hibiscus esculentus L．），又名秋葵，是锦葵科秋葵属一年生草本植物．黄秋葵的种植起源于非洲，具有悠久的栽培历史．20世纪90年代初，黄秋葵被引入我国，现在全国各地均有栽培．黄秋葵是一种具有较高经济价值的蔬菜，其果实、茎、叶、花、种子都具有一定的开发利用价值．黄秋葵含有丰富的粘性糖蛋白、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质和黄酮类化合物，既可以作为高档蔬菜，又可以开发成新型的保健食品．研究［1］表明黄秋葵果实具有丰富的营养和多种保健作用．杨毅等［2］通过小鼠负重力竭游泳实验发现黄秋葵水提物具有良好的抗疲劳作用．据报道［3］，黄秋葵多糖对人体肿瘤细胞的增殖具有抑制作用．另有研究［4］表明黄秋葵总黄酮类成分在体外具有抗氧化作用．

世界卫生组织和国际糖尿病联盟［5］预测，到2025年全球将有2．99～3．8亿糖尿病患者．越来越多的流行病学资料表明，新增患者主要集中在中国、印度等发展中国家．糖尿病与冠心病、肿瘤已成为当前影响人类健康的三大非传染性疾病．目前，糖尿病在治疗上主要有注射胰岛素、口服磺酰脲类和双胍类降糖药物等，但是这些药物都不同程度地存在一定的副作用［6］．此外，糖尿病在医疗和生活质量方面的高昂代价亦使得人们越来越关注糖尿病的替代疗法，利用植物中天然成分来改善及调节糖尿病患者的病情，已成为现阶段研究的热点问题之一．因此，从天然产物中寻找和开发高效低毒的治疗糖尿病的药物，具有重要意义．

张灵敏等［7］研究表明黄秋葵可以降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂水平．民间也有人发现食用黄秋葵果实具有一定的降糖作用，但也有人对此存疑．本研究通过糖尿病小鼠动物实验，进一步明确黄秋葵的降糖作用；并利用分子对接方法，对黄秋葵降糖的活性成分和作用机制进行了初步研究，为黄秋葵作为保健食品的进一步开发和利用奠定了基础．

1 材料和方法

1．1 材料和仪器 黄秋葵购自山东烟台，经辽宁中医药大学药学院翟延君教授鉴定为锦葵科秋葵属植物黄秋葵．4周龄SPF级昆明种小鼠90只，雌雄各半，体质量（20±2）g；啮齿动物基础饲料（粉状），购自辽宁省实验动物资源中心，动物生产许可证：SCXK（辽）2015-0001；四氧嘧啶（Alloxan，美国 Sigma公司）；盐酸二甲双胍缓释片（山东司邦得制药有限公司）；血糖试纸及测试仪（三诺生物传感股份有限公司）；电子天平；旋转蒸发仪．

1．2 实验方法

1．2．1 黄秋葵的制备 取新鲜黄秋葵果实，洗净切成小块状，粉碎机粉碎得质量为189．97 g的黄秋葵匀浆．按照1∶5的料液比加入去离子水950 mL进行浸提，浸提15 h．将得到的浸提液分别稀释和浓缩1倍，作为低浓度和高浓度样品，原提取液作为中浓度样品，冷藏备用．

1．2．2 糖尿病动物模型的建立及分组 试验分空白对照组、模型对照组、阳性对照组、高浓度组、中浓度和低浓度组共6组．购回的小鼠，适应性喂养3 d后，随机分成两组，一组为空白对照组（n＝6），另一组为糖尿病造模组．糖尿病造模组小鼠于禁食12 h后腹腔注射四氧嘧啶致糖尿病，四氧嘧啶造模用量分别170 mg／kg，60 mg／kg，因血糖值未完全升高，4 d 后按用量 80 mg／kg，160 mg／kg 继续给药，空白对照组注射等体积生理盐水．72 h后称重、断尾采血，测空腹血糖值．以血糖值＞10 mmol／L作为造模成功标准，除去空白对照组（n＝6）及血糖值未达标小鼠，成模率为59．3%．按照血糖值均衡原则将造模成功小鼠分成5组，每组10只．

1．2．3 黄秋葵的降糖作用 随机分组后次日开始每天用相应药物进行灌胃，分为黄秋葵高、中、低三个浓度组，阳性对照药为二甲双胍，空白对照组则用等体积生理盐水灌胃，灌胃量为 0．1 mL／10 g，共 15 d．灌胃结束后，禁食12 h，断尾取血测其血糖值，每日观察记录小鼠进食、饮水、尿量及皮毛、活动等情况．

1．2．4 活性成分的虚拟筛选 根据文献［8］报道，收集黄秋葵中已知化学成分61个，建立化合物数据集．从蛋白质结构数据库下载得到α-葡萄糖苷酶的晶体结构（3TOP．PDB）［9］．利用 Autodock Tool软件完成对蛋白晶体结构的处理，去掉结晶水，加上极性氢原子，并给所有原子加电荷．对于数据集中的化合物作类似的处理，保存成pdbqt格式．根据晶体结构中原有配体的位置，确定活性位点的中心位置为（-30．97 Å，36．36 Å，25．01 Å），网格盒子（Grid Box）大小设置为20 Å×20 Å×20 Å．分子对接用 Autodock Vina［10］软件实现，其余参数均采用缺省值．

1．3 统计学处理 采用SPSS19．0统计学软件对数据进行分析，实验数据均用±s表示，多组间均数比较用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法（least significant difference， LSD），P＜0．05 表示差异具有统计学意义．

2 结果

2．1 黄秋葵对糖尿病小鼠血糖及体质量的影响 模型组小鼠的血糖均达到了10．74 mmol／L以上，显著高于空白对照组，差异具有统计学意义（P≤0．01），且小鼠精神萎靡，活动明显减少，皮毛干燥粗糙而稀疏，具有多饮、多尿的症状．模型组小鼠的平均体质量明显低于空白对照组小鼠的体质量，差异具有统计学意义（P≤0．01），说明糖尿病小鼠模型造模成功．在灌胃15 d后，给药组小鼠的血糖较模型对照组至少低 3 mmol／L，差异具有统计学意义（P≤0．05），说明黄秋葵水提物能够在一定程度上降低糖尿病小鼠的血糖，降糖效果和阳性药物二甲双胍具有一定可比性．其中，高剂量组灌胃前后降糖作用最显著（P≤0．01），说明黄秋葵降糖存在一定的量效关系．灌胃15 d后小鼠体质量均有所增加，但空白对照组、给药组与模型对照组相比体质量显著增加，差异具有统计学意义（P≤0．01，表1），说明黄秋葵可以改善小鼠的糖尿病症状．

表1 糖尿病小鼠的空腹血糖值变化

2．2 黄秋葵对α-葡萄糖苷酶的抑制作用 分子对接计算结果表明，所考察的黄秋葵中包含61种化合物与α-葡萄糖苷酶的结合自由能均处于-10．2和-7．1 kcal／mol之间，说明这些成分对于 α-葡萄糖苷酶具有不同程度的抑制作用．从化合物的种类来看，结合能较低的以甾醇类化合物为主．我们给出了5个代表性甾醇类化合物的结合自由能及抑制常数（表2）．这些物质的结合自由能比较接近，最低的豆甾-4-烯-3，6-二酮（-10．2 kcal／mol） 与最高的 β-谷甾醇（-9．9 kcal／mol）仅差了-0．3 kcal／mol．我们也给出了这五个活性物质与葡萄糖苷酶的结合构象（图1）．从中可以看出，α-葡萄糖苷酶的活性位点具有较强的疏水性（图中灰色区域）．这五个甾醇类化合物与α-葡萄糖苷酶的结合构象十分类似，即均将疏水的一端插入空腔的内部，而含有亲水的羰基或羟基的暴露在外面．对结合能最低的豆甾-4-烯-3，6-二酮与α-葡萄糖苷酶的结合模式作了进一步分析（图2）．可以看出，豆甾-4-烯-3，6-二酮利用自身的疏水性与在α-葡萄糖苷酶的活性位点的一些疏水性残基，包括PHE1559，PHE1560、TYR1251、TRP1355、TRP1369 等形成疏水相互作用．值得指出的是，豆甾-4-烯-3，6-二酮中6位的羟基作为氢键受体与ARG1460上的胍基形成氢键相互作用，而其余四个化合物与α-葡萄糖苷酶之间则不存在这种强相互作用．这也许是豆甾-4-烯-3，6-二酮对α-葡萄糖苷酶抑制作用稍强的原因．

表2 化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制常数

图1 甾醇类化合物与α-葡萄糖苷酶的对接构象

图2 豆甾-4-烯-3，6-二酮与α-葡萄糖苷酶作用模式分析

3 讨论

化学物质诱导糖尿病动物模型是应用化学物质损伤胰腺β细胞，从而引发动物的糖尿病．目前常用药物有链脲菌素和四氧嘧啶［11］．由于四氧嘧啶能够快速成模，在小鼠糖尿病模型中比较常用，故本研究采用四氧嘧啶造模．对于糖尿病小鼠模型，经过15 d的灌胃后，通过测定小鼠的空腹血糖值发现，给药组小鼠血糖较模型组均有所降低（P≤0．05），据此推断黄秋葵有一定的降糖作用．此结果与张灵敏等［7］的研究结果基本一致．利用分子对接方法，以α-葡萄糖苷酶为靶标，我们对黄秋葵中所含的化学成分进行了筛选．结果表明黄秋葵中甾醇类成分对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用．这说明抑制α-葡萄糖苷酶的活性，降低小鼠的糖吸收，是黄秋葵发挥降糖作用的可能机制之一．Sabitha等［12］曾研究了黄秋葵种皮和种子粉末对抗糖尿病和抗高血脂的生理活性，其中活性物质主要是由半乳聚糖、阿拉伯聚糖、果胶类多糖及少量糖蛋白组成的混合物．果胶类多糖为可溶性纤维，能够降低血糖，提高胰岛素敏感性［13-14］．有研究［15］表明，多糖在恢复胰岛β细胞功能的同时，对于改善糖代谢，抑制肝糖输出起着极为重要的作用，并能修复受损的胰岛组织与肝组织细胞．由此推测，黄秋葵的降糖作用应该是多组分多靶点协同作用的结果．

4 结语

本研究以小鼠糖尿病模型为研究对象，结果表明黄秋葵水提物可以降低糖尿病小鼠的血糖，改善小鼠多饮、多食、多尿等症状．分子对接结果表明，黄秋葵中的甾醇类成分可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性，是黄秋葵降糖作用的可能机制之一．我们的研究结果证实，黄秋葵具有一定的降糖作用，值得进一步开发．

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The hypoglycemic action of oksa on diabetic mice

FENG Guan-Ying， SONG Xiao-Xue， XU Zhi-Li， LUAN Ze-Zhu，ZHANG Ming-Bo
Pharmacy College，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China

AIM： To investigate the effect of water extract of oksa on diabetes mellitus（DM） model mice and the underlying mechanism．METHODS： The diabetic mice model was established by feeding alloxan；The diabetic mice was fed with water extract of oksa once a day；Then the variations in the blood glucose of the model mice was measured daily．The inhibitors of α-glucosidase contained in oksa was screened with molecular docking method．RESULTS： Water extract of oksa can reduce the concentration of blood glucose of model mice （P≤0．01） in a dose-dependant way．Sterol ingredients contained in oksa can stabilize with α-glucocidase， among which there are five compounds with binding free energies lower than-9．9 kcal／mol．CONCLUSION：Oksa may play a role in reducing the blood glucose of model mice in which α-glucocidase activity was inhibited by its sterol ingredients．

oksa； diabetes； water extract； hypoglycemic action

R285．5

A

2095-6894（2017）11-44-04

2017-05-30；接受日期：2017-06-18

辽宁省大学生创新项目（201510162000020）

冯冠英．研究方向：保健食品．

E-mail：fengguanying＠ 126．com

张明波．博士，副教授．研究方向：药物虚拟筛选和中药药效物质基础．E-mail：mbzhang＠ 126．com