钴-银纳米微粒的制备及抑菌活性的初步探索

张国超，高 琪，魏小乐，何 琦，姜 宇，马兴铭，袁苗苗

（1兰州大学基础医学院，甘肃兰州730000；2南方医科大学基础医学院，广东 广州510000）

钴-银纳米微粒的制备及抑菌活性的初步探索

张国超1，高 琪1，魏小乐1，何 琦1，姜 宇1，马兴铭1，袁苗苗2

（1兰州大学基础医学院，甘肃兰州730000；2南方医科大学基础医学院，广东 广州510000）

目的：制备钴-银纳米微粒，并初步探讨钴-银纳米微粒对细菌的抑制效果．方法：利用水热合成法制备出不同银含量的钴-银纳米微粒．运用扫描电子显微镜表征钴-银复合纳米材料，并评价其对常见细菌的杀灭效果．结果：钴-银复合微粒粒径约为10 μm，银含量不同的钴-银复合纳米材料均显示出抑菌作用，尤其银含量高的钴-银复合纳米材料抗菌效果较好．钴-银复合纳米材料可以通过磁场力将其回收，钴-银纳米复合材料回收率为98%，回收的钴-银纳米复合材料仍有抑菌作用，并可以重复使用又可以减少对环境的污染．结论：制备的钴-银纳米微粒具有较好的抑菌活性和较高的回收率，回收得到的材料依旧有很好的抗菌效果．

纳米材料；抗菌作用；可回收材料

0 背景

致病菌的传播和蔓延严重威胁着人类的生存和健康［1］．抗菌素的过度使用又给我们带来了耐药菌、超级细菌．近年来，纳米杀菌材料以自身理化性质对细菌的杀灭作用使其有望成为新型抗菌物质．目前所报道的纳米杀菌材料包括 TiO2、ZnO、CuO、Ca（HO）2、MgO、壳聚糖、银等［2-8］．在这些杀菌材料中，银及其复合物能够广泛地杀死细菌、病毒等微生物，是较为有效的抗菌剂．临床上使用载银医用敷料可以杀灭伤口上的细菌，避免伤口的感染，且可以促进慢性伤口的愈合［9］．与无涂层的外科缝线相比，涂有载银生物活性的外科缝线抑制细菌粘附能力更强［8］．此外，载银系抗菌材料还用于导尿管、纤维织物、抗菌塑料等［10-12］．在水处理方面，TiO2很早被用于废水处理系统［13］，然而银及其含银复合物在机体中累积过多会引起严重的银中毒，处理后这些化学材料的移除会增加额外的时间和成本，因此，含银复合物在水处理方面的应用研究较少．将银包覆在磁性粒子表面，通过外加磁场回收将是一种成本低、效率高的移除方法．本研究利用水热合成法制备了钴纳米微粒，以钴纳米微粒为载体，在水溶液中制备了表面载银的钴-银复合纳米材料，以水中细菌为检测对象，并初步评价了其抑菌效果，结果表明磁性钴-银复合纳米材料具有良好的抑菌效果，具有回收方便、重复利用的特点，可以作为一种新型的杀菌材料．

1 材料和方法

1．1 主要试剂 分析纯六水合氯化钴（CoCl2·6H2O）购自中国医药（集团）上海化学试剂公司，分析纯水合肼（N2H4·H2O）、乙二胺四乙酸（EDTA）购自天津市大茂化学试剂厂，硝酸银（AgNO3）购自国药集团试剂公司．胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID公司．

1．2 标准菌株 大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌菌A209由兰州大学基础医学院免疫学研究所保存．

1．3 钴-银纳米微粒的制备 称6 gNaOH溶于10 mL蒸馏水中，配成15 mol／L的溶液，冷却至室温；称1．442 g CoCl2·6H2O溶解到48 mL蒸馏水中配成6 mmol／L的溶液；将配好的CoCl2·6H2O溶液逐滴滴入NaOH溶液中，搅拌至分散均匀；依次加入3．5245 g EDTA、16 mL水合肼、75 mL乙醇，得到混合溶液；将混合溶液转移到聚四氟乙烯容器中，放入高压反应釜中，震荡摇均，160℃反应20 h得到钴纳米粉末；分别用无水乙醇和去离子水反复洗涤多次，放置于60℃烘箱中干燥．在烧杯中，依次加入去离子水90 mL，钴纳米粉末 100 mg，64．1 mg AgNO3，搅拌 1 h，5000 rmp离心得到钴-银纳米沉淀；依次用去离子水和无水乙醇超声、离心洗涤数次，冷冻干燥备用．以相同的方法制备银含量不同的钴-银纳米微粒，AgNO3的投入量分别为 128．1 mg、192．2 mg．获得低、中、高银含量不同的三种钴-银纳米微粒．

1．4 钴-银纳米微粒的表征 采用场发射扫描电子显微镜（Kevex JSM-6701F，Japan）对合成的钴-银纳米微粒样品的表观形貌进行观察．

1．5 钴-银纳米微粒的体外最小抑菌浓度的测定（minimum inhibitory concentration， MIC） 取高压灭菌的三种钴-银纳米微粒各0．04 g，溶于无菌PBS液（pH＝7．4） 4 mL，配成10 μg／μL 溶液．取24 孔板，每孔中加入2 mL菌液（大肠杆菌／金黄色葡萄球菌1．0×105CFU／mL），加入钴-银纳米微粒溶液并稀释为20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280 μg／μL 的不同浓度，37℃、180 rmp 培养 24 h，肉眼观察以无细菌生长的最低浓度为钴-银纳米微粒的MIC，实验重复三次．

1．6 钴-银纳米微粒的二次抑菌作用测定 确定不同银含量的钴-银纳米微粒对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的首次抑菌浓度后，将磁铁放到24孔板下40 min后，缓慢弃掉孔中的菌液，用生理盐水洗涤三次，重新加入 2 mL 菌液（1．0×105CFU／mL）37℃、180 rmp培养24 h，肉眼观察以无细菌生长的最低浓度为钴-银纳米微粒的MIC，实验重复三次．

1．7 钴-银纳米微粒回收率测定 取12 mL的培养管，将不同银含量的钴-银纳米微粒与水（方法同1．6）按比例混合，并37℃、180 rmp作用24 h．将磁铁放到培养管下方40 min左右，待钴-银纳米微粒被磁铁吸引到培养管底部，缓慢弃掉培养管中的细菌菌液，60℃干燥至离心管恒重．根据下面公式计算回收率：回收率＝回收量／投入量×100%．

1．8 统计学处理 采用SPSS21．0统计学软件进行分析，配对样本t检验对首次和二次回收的钴-银纳米微粒作用不同菌种最小抑菌浓度进行配对分析．

2 结果

2．1 钴-银纳米微粒的表征 钴-银纳米微粒的扫描电子显微镜形貌如图1所示，制备出单分散和花形的钴-银纳米微粒．钴-银纳米微粒粒径较均匀，且在水中分散较好，平均粒径约为10 μm．

图1 钴-银纳米微粒的扫描电子显微镜结果

2．2 钴-银纳米微粒对细菌的抑制作用 钴-银纳米微粒对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC见表1．钴-银纳米微粒和二次回收的钴-银纳米微粒对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长均能够显示出抑菌作用．随着钴-银纳米微粒中银含量的升高，抑菌效果越明显．与首次钴-银纳米微粒作用于不同菌种的最小抑菌浓度相比，二次回收的最小抑菌浓度增高，差异有统计学意义（P＜0．05，表 2）．

表1 钴-银纳米微粒对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC（μg／mL）

表2 钴-银纳米微粒首次和二次抑制大肠杆菌、经黄色葡萄球菌的MIC差异比较

2．3 钴-银纳米微粒的回收测定 将干燥后的高银含量的钴-银纳米微粒进行称重，计算回收率，测得回收率为98%．

3 讨论

金属类纳米杀菌剂有 Ag+、Zn2+、Cu2+、 Hg2+等许多重金属离子，其中杀菌效果好且对人体毒性最小金属类杀菌剂是Ag+．Ag+也是目前研究最多的离子杀菌剂．银离子对12种革兰氏阴性菌、8种革兰氏阳性菌、6种霉菌均有强烈的杀灭作用，具有成为抗菌材料的潜力［14］．磁性纳米粒子以粒径均一、表面积大、超顺磁性等优点被广泛用于硬质合金、污水处理、电池等行业和催化剂、磁性材料、吸波材料、陶瓷等领域［15-16］，其中与铁、镍纳米粒子相比较，钴纳米粒子具有磁性更强、更容易团聚的特点．因此，钴纳米载体微粒得到了较为广泛的应用．

本实验利用水合肼液相还原法制得钴纳米微粒，将AgNO3溶液中的银离子还原出来，并覆盖在钴纳米材料上，制备成钴-银纳米微粒．这种钴-银纳米微粒既具有金属银的杀菌性又有金属钴的强磁性．钴-银纳米微粒既能够抑制水中常见细菌生长，又通过磁场力作用可以再次回收利用，降低金属银的的污染和毒性，有效地抑制了水中的常见菌群，为污水治理提供了新方法．从长远来看，可回收钴银纳米材料技术将会节约企业生产成本，经回收后减少对周边环境造成影响，循环利用，尤其在细菌滋生的污水处理方面具有潜在的应用价值，但其制备工艺完善，对水质、细菌等影响以及抑菌机制需要进一步研究和评价．

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Preparation of cobalt-silver nanoparticles and preliminary study on its antibacterial activity

ZHANG Guo-Chao1， GAO Qi1， WEI Xiao-Le1， HE Qi1， JIANG Yu1， MA Xing-Ming1， YUAN Miao-Miao21School of Basic Medical Sciences， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China；2School of Basic Medical Sciences， Southern Medical University， Guangzhou 510000， China

AIM： To study the preparation of cobalt-silver nanoparticles and its antibacterial activity．METHODS： Co-Ag composite nano-materials with different silver contents were prepared by hydrotherma synthesis．The scanning electron microscopy（SEM） was used to characterize these products， whose antibcuterialeffects on common bacteria were evaluated．RESULTS：The size of cobalt-silver nanoparticles is about 10 μm．Co-Ag composite nano-materials with different contents of silver have good antibacterial efficacy．With the content of silver increased， the antibacterial effect becomes better．Co-Ag composite nano-materials can be recycled by the magnetic field，with a higher recovery rate of 98%．CONCLUSION： The recycled product also has the antibacterial effect．Co-Agcomposite nano-materials not only has the higher recovery rate，but also can reduce the pollution to the environment．

nanomaterials； antibacterialeffect； recyclable materials

TB44；TF123

A

2095-6894（2017）11-39-03

2017-06-13；接受日期：2017-06-28

兰州大学中央高校基本科研业务费专项基金（lzujbky-2017-117）

张国超．硕士生．E-mail：18238838551＠ 163．com通讯作者：马兴铭．博导．E-mail：maxm＠ lzu．edu．cn

袁苗苗（共同通讯作者）．博士．E-mail：yuanmm2007＠ 126．com