S100B基因rs881827多态性与缺血性脑卒中的遗传易感性研究

陆玉兰 黄华佗 王荣 刘纯宏 蓝艳 韦叶生

【摘要】目的探讨星形胶质源性蛋白（S100B）基因单核苷酸多态性（SNP）rs881827与缺血性脑卒中（IS）的相关性。

方法采用单碱基延伸的PCR技术（SBEPCR）和DNA测序法对396例IS患者（病例组）及398例体检者（对照组）的S100B基因rs881827位点进行基因分型；用非条件Logistic回归计算比值比（OR）、95%置信区间（95%CI）、显性模型（TT/CT vs.CC）、隐性模型（CT/CC vs.TT）和超显性模型（CC/TT vs.CT），从而分析rs881827多态性与IS的发病风险。

结果两组间基因型和不同遗传模型比较结果显示，rs881827位点SNP可能与IS的遗传易感性无关（CT vs.TT：OR=0.79，95%CI 0.54～1.15，P=0.22； TT vs.CC：OR=0.65，95%CI 0.38～1.09，P=0.10；TT/CT vs.CC： OR=0.75，95%CI 053～1.07，P=0.12；CT/CC vs.TT：OR=0.74，95%CI 0.46～1.19，P=0.22；CC/TT vs.CT：OR=0.90，95%CI 0.64～1.26，P=0.53）。

结论S100B基因rs881827位点SNP可能与IS的遗传易感性无关。

【关键词】S100B；缺血性脑卒中；单核苷酸多态性；易感性

中图分类号：R743.3；R394 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2017.05.001

Study on polymorphisms of rs881827 in S100B gene and geneticsusceptibility to ischemic stroke

[HJ2][HJ]

LU Yulan1，HUANG Huatuo1，WANG Rong1，LIU Chunhong3，LAN Yan2，WEI Yesheng3▲

（1.Graduate School，2.Department of Dermatology of Affiliated Hospital，3.Department of Laboratory Medicine of Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

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【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between single nucleotide polymorphism（SNP）rs881827 in S100B gene and susceptibility to ischemic stroke（IS）.

MethodsSNP rs881827 genotyping in S100B gene was performed by polymerase chain reactionsingle base extension PCR（SBEPCR）and DNA sequencing among 396 cases of IS patients（case group）and 398 physical examinees（control group）.Odds ratio（OR），95% confidence intervals（95%CI），dominant model（TT/CT vs.CC），recessive model（CT/CC vs.TT）and over dominant model（CC/TT vs.CT）were measured by unconditional Logistic regression analysis to analyze the risk of rs881827 polymorphism and IS.

ResultsComparison of genotypes and different genetic models between the two groups showed that SNP in rs881827 locus may be unrelated to the genetic susceptibility of IS（CT vs.TT：OR=0.79，95%CI 0.54～1.15，P=0.22；TT vs.CC：OR=0.65，95%CI 0.38～1.09，P=0.10；TT/CT vs.CC：OR=0.75，95%CI 0.53～1.07，P=0.12；CT/CC vs.TT：OR=0.74，95%CI 0.46～1.19，P=0.22；CC/TT vs. CT：OR=090，95%CI 0. 64～1.26，P=0.53）.

ConclusionS100B gene rs881827 polymorphism may be not associated with susceptibility to IS.

【Key words】S100B；IS；SNP；susceptibility

缺血性脑卒中（Ischemic stroke，IS）是由多因素共同参与而导致的一类复杂疾病，具有高发病率、高致残率、高复发率和高死亡率的特点，给社会和家庭带来沉重的经济负担[1]。近年来，我国IS的发病率逐年上升，而且发病人群呈年轻化趋势[2]。流行病学研究表明年龄、性别、肥胖、高血压、糖尿病、吸烟和血脂异常等传统因素与IS的发病密切相关[3]。然而，IS的确切病因及發病机制至今尚未完全阐明。越来越多的家族性病例报道说明IS有明显的遗传倾向[4]。星形胶质源性蛋白（S100B）是一种主要由星形胶质细胞分泌的酸性钙结合蛋白，为S100超家族中的成员之一。S100B可通过与晚期糖基化终末产物受体（RAGE）结合后激活蛋白激酶/cJun氨基末端激酶（JNK）通路及P38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，从而导致细胞应激和细胞凋亡[5～6]。此外，S100B与RAGE结合可诱导IL1、IL6、IFNγ、TNFα等细胞因子表达上调，从而参与机体免疫调控和炎症反应[7]。既往研究表明，S100B蛋白可作为辅助诊断缺血性脑卒中、颅脑损伤和肿瘤脑转移的有效指标[8～10]。随着分子生物学技术的不断发展，人们发现编码S100B基因存在单核苷酸多态性（SNP）位点，而这些SNP位点与自闭症、精神分裂症等多种疾病密切相关[11～12]。然而，S100B基因多态性与IS发病是否相关尚未见报道。因此，在本研究中，我们通过病例对照研究的方法，探讨S100B基因多态性与IS的发病风险，为从分子水平上揭示IS的发病机制提供依据，也为尽快发现IS的危险人群、预防IS的发生提供重要的参考信息。endprint

1资料与方法

1.1研究对象

对照组：随机选取同一时期到右江民族医学院附属医院体检中心进行体检的体检者398例，其中男性231例，女性167例，平均年龄（58.09±8.76）岁，所有研究对象均来自广西地区，且相互无血缘关系。排除自身免疫性疾病、肿瘤、心脑血管疾病及感染性疾病等。本研究获得右江民族医学院附属医院医学伦理委员会的批准。所有受试对象均已签署知情同意书。IS组：选取2013年1月～2016年9月入住右江民族医学院附属医院神经内科，与对照组性别、年龄相匹配的IS患者396例，其中男性252例，女性144例，平均年龄（59.16±9.18）岁。IS的诊断均符合第四届全国脑血管病学术会议的诊断标准。全部IS患者均经头颅CT或MRI扫描确诊，不包括心源性、动脉炎、外伤、肿瘤、脑血管畸形等引起的脑卒中。

1.2实验方法

1.2.1基因组DNA提取采集体检者静脉血3 ml，用含有EDTAK2抗凝剂的采血管保存；采用试剂盒离心柱法（TIANamp Blood DNA Kit）进行基因组DNA提取，-70℃保存备用。

1.2.2引物设计与合成从NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获取S100B基因SNP序列，用在线Primer3 软件（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）辅助设计PCR引物，并由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特异性扩增的S100B基因rs881827引物序列详见表1。

1.2.3PCR扩增采用20 μL反应体系，其中包括1× GCⅠ缓冲液（Takara.）、1 μL多重PCR引物、1 U HotStarTaq聚合酶（Qiagen Inc.）、3.0 mM镁离子、0.3 mM dNTP、1 μL DNA模板，余下体积用经过严格高压灭菌的双蒸水补足。PCR反应参数：95℃预变性 2 min；扩增阶段：94℃预变性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，循环11次；94℃预变性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，循环24次；最后阶段72℃延长2 min。PCR产物用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR获得，PCR产物经过虾碱酶（SAP：from Promega） 和外切酶I（EXO I：from Epicentre）纯化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用虾碱酶（SAP：from Promega）纯化后在ABI3730xl上样。SNP分型用GeneMapper4.1（Appliedbiosystems）来分析（由上海天昊科技有限公司承做）。

1.3临床基本资料收集

利用医院的病例管理系统收集已确诊为IS患者的临床基本资料，主要包括性别、年龄、高血压、糖尿病、吸烟、总胆固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）和极低密度脂蛋白胆固醇（VLDLC）等。吸烟定义为吸烟≥1支，且一生中连续或累积吸烟≥6个月。

1.4统计学方法

用SPSS 17.0软件包对实验数据进行分析。采用HardyWeinberg遗传平衡定律评估样本的群体代表性；计量资料用（±s）表示，采用t检验。分类变量采用χ2检验；经相关混杂因素（性别、年龄、高血压、糖尿病、吸烟、TCH、TG、HDLC、LDLC和VLDLC）调整，采用非条件Logistic回归方法计算对照组与IS组的显性模型（TT/CT vs.CC）、隐性模型（CT/CC vs.TT）和超显性模型（CC/TT vs.CT）的比值比（OR）、95%置信区（CI）。检验水准：α=0.05，双侧检验。

2结果

2.1S100B基因rs881827基因型测序结果经检验S100B 基因rs881827位点基因型分布符合HardyWeinberg平衡（P值为0.902），表明本研究具有群体代表性。测序结果显示，rs881827位点包含TT、CT、CC三种基因型，DNA测序证实了我们的结果。见图 1。

2.2IS组和对照组的基本临床资料IS患者和对照者的性别、年龄和TCH分布差异无统计学意义（P>0.05），而高血压、糖尿病、吸烟、TG、HDLC、LDLC、VLDLC在两者间比较差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。见表2。

2.3S100B基因多态性rs881827 SNP与IS易感性的关联分析分析比较对照组和IS组S100B基因rs881827位点的基因型频率和等位基因频率，结果显示，IS患者的CC基因型（37.2%）、CT基因型（492%）、C等位基因（61.7%）高于对照组的CC基因型（34.4%）、CT基因型（48.2%）、C等位基因（585%），但两组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。同时，我们采用非条件Logistic回归方法分析两组间基因型和不同遗传模型的比较，结果表明，S100B基因rs881827位点SNP可能与IS的遗传易感性无关（CT vs.TT：OR=0.79，95%CI 0.54～115，P=0.22；TT vs.CC：OR=0.65，95%CI 0.38～109，P=0.10；TT/CT vs.CC：OR=0.75，95%CI 0.53～107，P=0.12；CT/CC vs.TT：OR=0.74，95%CI 046～119，P=0.22；CC/TT vs.CT：OR=0.90，95%CI 0.64～126，P=0.53）。见表3。

2.4S100B基因rs881827多态性与不同人群的比较经分析，广西人群S100B基因rs881827位点基因型和等位基因频率分布与国际人类基因组单体型图计划数据库（Hap Map）的Hap MapCEU、Hap MapYRI、Hap MapJPT、Hap MapHCB、Hap MapASW、Hap MapGIH、Hap MapLWK、Hap MapMEX人群相比差异有统计学意义（P<0.05）；与Hap MapCHB相比，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。endprint

3讨论

IS是由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血、缺氧而发生的软化坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现，严重影响患者的生存质量。目前认为IS是一种由环境因素与遗传因素共同作用诱发的复杂疾病。

S100B基因定位人类染色体21q22.3区域，包含3个外显子和2个内含子，mRNA长度为1095bp，编码91个氨基酸。其启动子区包括数个潜在的调控转录成分，如CAMP反应元件CRE和AP2、SP1结合位点GC框。S100B主要由星形胶质细胞和施万细胞表达，是S100蛋白超家族中具有活性的成员，约96%存在于脑内，因此被称为脑特异性蛋白。高浓度的S100B可通过与晚期糖基化终末产物受体（RAGE）结合后激活多种信号通路，从而诱导IL1、IL6、IFNγ和TNFα等多种细胞因子的释放，而这些细胞因子被发现在IS的发病中均起着重要的作用[13～14]。此外，高浓度的S100B可发挥神经毒性作用，通过一氧化氮依赖途径诱导神经元细胞凋亡[15]。同时，越来越多的研究表明，S100B蛋白表达水平在IS的发生、发展中发挥重要的作用，Selcuk等[16]检测50例IS患者的S100B血清水平发现，与对照组比较，IS组S100B血清水平显著升高，且S100B浓度随脑梗死体积的增大而增加。Mori等[17]研究发现大脑中动脉闭塞的小鼠中，超表达S100B组梗死面积和神经功能损伤程度较对照组明显严重，认为大脑中动脉闭塞后超表达的S100B可加速脑损伤及增大梗死面积。然而，S100B蛋白在IS中的表达机制目前仍未明确。

近年来已有一些文献报道S100B基因多态性与疾病遗传易感性关系的研究[11～12，18]。然而S100B基因rs881827 SNP是否与IS遗传易感性相关，目前尚未见文献报道。在本次研究中我们发现，S100B基因rs881827位点SNP可能与IS的遗传易感性无关。产生此结果的可能原因有：首先，IS是一种复杂性疾病，可能是由很多基因参与其发病过程，一个单独基因在其发病原因中起的作用很小，而更多的是基因与基因之间的交互作用的结果。其次，本研究所选取的样本量较小以及样本选择的偏倚也可能是造成此阴性结果的原因之一。最后，既往研究结果表明，同一个位点SNP在不同人群、不同疾病中所发挥的作用并不一致，因此，S100B基因rs881827 SNP可能與广西人群IS的遗传易感性无关，但是其可能与其他人群的IS发病具有相关性，这是我们后续的研究方向。此外，值得注意的是，基因多态性有不同种族和不同地区人群间的差别，正如表4所示，我们发现，广西人群rs881827位点基因型在不同种族间甚至在同一种族不同人群间的分布也表现出不同程度的差异。因此，拥有不同遗传背景的人群对疾病的遗传易感性也有可能不同。

综上所述，虽然我们通过多方面系统地分析发现，S100B基因rs881827位点SNP可能与IS的遗传易感性无关。但是，基因多态性有不同种族和地区人群间的差别，因此，该结果仍需要经大样本、多地域、多民族的广泛深入研究，以期为IS的风险预测、治疗以及评估预后提供一条新的线索和途径。

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（收稿日期：2017-06-09修回日期：2017-07-04）

（編辑：潘明志）endprint