林麝源解没食子酸链球菌的分离鉴定及进化分析

姜俊庆 ， 程建国 ， 赵 位 ， 罗 燕 ， 王吴优 ， 田 青

(1.四川养麝研究所 ， 四川 都江堰 6118301 ； 2.四川农业大学动物医学院 ， 四川 温江 611130)

林麝源解没食子酸链球菌的分离鉴定及进化分析

姜俊庆1， 程建国1， 赵 位2， 罗 燕2， 王吴优2， 田 青2

(1.四川养麝研究所 ， 四川 都江堰 6118301 ； 2.四川农业大学动物医学院 ， 四川 温江 611130)

采用传统的细菌鉴定方法和分子生物学方法，对四川省某养麝场2只患化脓性疾病林麝病原菌进行生理生化特征和16S rRNA基因序列测定，以小鼠感染试验测试分离菌株的致病性，用K-B纸片扩散法进行药敏试验，并通过构建进化树对分离菌株进行进化分析。该研究分别从2只林麝机体内分离出1株解没食子酸链球菌解没食子酸亚种和1株解没食子酸链球菌马其顿亚种，两分离菌均能够引起小鼠肝脏肿大，且对多类抗生素产生耐药性，进化分析显示，2分离菌处于不同的分支。本试验结果为进一步研究解没食子酸链球菌以及林麝化脓性疾病奠定基础。

林麝 ； 解没食子酸链球菌 ； 分离鉴定 ； 进化分析

解没食子酸链球菌(Streptococcusgallolyticus)属于牛链球菌。自1990年Osawa[1]首次于树袋熊的排泄物中分离出该菌并命名以来，在人、家畜、家禽、野生动物以及水生动物机体内也分离到该致病菌[2]。该菌属于D族链球菌，其可用作食品发酵，也可引起动物感染。作为机会感染致病菌，解没食子酸链球菌在临床上可引起各种感染性疾病，如腹膜炎、尿路感染、菌血症以及结肠/直肠癌等[3-6]。在早期研究中解没食子酸链球菌生物学分类存在很大的争议。至2003年，Schlegel等[7]将解没食子酸链球菌分为3个亚种，即：解没食子酸亚种、巴氏亚种和马其顿亚种。到目前为止，临床上对解没食子酸链球菌的分离还比较少，而对于不同亚种之间的研究罕见有报道。

本研究分别从2只病死林麝的肝脏和肺脏中分离出了1株疑似解没食子酸链球菌解没食子酸亚种和1株疑似解没食子酸链球菌马其顿亚种。对其进行形态学、生理生化和分子生物学诊断，并对其进行耐药情况调查和致病性研究。最后，通过构建进化树，分析2株解没食子酸链球菌不同亚种的进化地位。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 5%犊牛血清的胰蛋白大豆琼脂(Tryptic soy agar, TSA)平皿、生化反应管以及药敏纸片，2×TaqPCR Master Mix Kit和细菌基因组DNA提取试剂盒。供药敏试验的纸片抗生素的种类包括：链霉素、庆大霉素、头孢匹胺、环丙沙星、青霉素、丁胺卡那霉素、氧氟沙星、头孢噻吩、氟苯尼考、氨苄西林、头孢哌酮、头孢他啶、亚胺培南、卡那霉素和林可霉素。

1.2 样品采集及菌株分离 于四川某养麝场分别采集2只不同病死林麝的肝脏和肺脏，密封于无菌采样袋，送往实验室立即进行细菌分离。将肝脏和肺脏划线接种于TSA平皿，每个样品3个重复，经37 ℃恒温培养箱培养24 h后挑选单菌落划线纯化，最后进行革兰染色，确定为纯培养物后，甘油保存于-70 ℃冰箱，备用。

1.3 生理生化鉴定 将保存的菌种划线接种于TSA平皿，培养18 h后观察菌落大小、形态和颜色，然后采用细菌微量生化反应管依据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行生理生化鉴定，操作步骤按照细菌微量生化反应管的说明书进行。

1.4 分子生物学鉴定 将纯化的菌种接种于TSA平皿，于37 ℃恒温培养18 h，无菌生理盐水洗下，提取基因组DNA，作为模板，进行PCR扩增。所用引物为：27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3'; 1492R:5'-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3'。PCR扩增体系为：2 ×TaqPCR Master Mix 25 μL，10 mmol/L 27F引物2 μL，10 mmol/L 1492R引物2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，并在NCBI上进行比对。

1.5 小鼠的致病性试验 将24只7周龄的BALB/c小鼠平均分成3个组(雌雄各半)，分别命名为A、B、C。同时将菌株划线接种于TSA平皿，培养18 h后用无菌生理盐水洗下，制成菌液。然后用平板计数法测定活菌浓度，将菌液浓度调整为109CFU/mL。将调整浓度后的肝脏、肺脏分离菌菌液分别腹腔接种于A, B组小鼠，0.5 mL/只，C组注射等量的生理盐水作为对照组。饲养14 d，记录小鼠死亡数量和死亡时间，并对感染死亡小鼠进行剖检，观察并记录内部脏器的病理变化。

1.6 药敏试验 采用美国临床实验室和标准协会(CLSI)推荐的K-B法进行药敏试验，先将分离菌株增菌培养，10倍倍比稀释后涂布MH琼脂平板，分别将药敏纸片贴于平板上。最后，将贴好的药敏纸片的MH琼脂平板置于37 ℃恒温培养18 h，试验结果根据CLSI的标准判读。

1.7 分子进化分析 在NCBI上对分离到的2个菌株的16S rRNA基因序列进行同源性分析，采用Clustalx与从GenBank 数据库中获得的解没食子酸链球菌16S rRNA基因序列进行多序列比对，并用Mega 6.0构建进化树。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离培养 将病死2只病死林麝的肝脏和肺脏划线培养18 h后，在TSA培养基上，均形成透明、圆形、光滑的小菌落，革兰染色可见紫色呈链状排列或单个存在的革兰阳性球菌。

2.2 菌种的生理生化性质 各项生理生化指标检测试验发现，肝脏和肺脏分离菌株菌发酵葡萄糖、乳糖、尿素以及V-P 反应均表现为阳性，在棉籽糖、甘露醇、海藻糖发酵过程中肝脏分离株表现为阳性，而肺脏分离株表现为阴性。同时，在对阿拉伯糖发酵过程中肝脏分离株表现为阴性，而肺脏分离株表现为阳性。以上结果中，肝脏分离株符合解没食子酸链球菌解没食子酸亚种的生理生化特征，而肺脏分离株符合解没食子酸链球菌马其顿亚种的生理生化特征。

2.3 分子生物学鉴定 肝脏、肺脏分离菌株16S rRNA基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，可见大小分别约为1 200 bp和1 400 bp的条带。将目的条带胶回收后测序，结果表明，肝脏和肺脏分离株16S rRNA基因大小分别为1 274 bp和1 453 bp。将序列提交至GenBank数据库，登录号分别为：KU323659和KY693647。并在NCBI上分别对2分离菌株16S rRNA基因序列进行BLAST比对分析。结果显示，肝脏分离菌株的16S rRNA基因序列与解没食子酸链球菌解没食子酸亚种16S rRNA基因序列相似性达99%，因此确定该分离菌为解没食子酸链球菌解没食子酸亚种，命名为FMDD_5。肺脏分离菌株的16S rRNA基因序列与解没食子酸链球菌马其顿亚种16S rRNA基因序列相似性达99%，因此确定该分离菌为解没食子酸链球菌马其顿亚种，命名为LPSM。

2.4 菌种对小鼠的致病性 A组和B组感染试验小鼠精神委靡、食欲不振，剖检均可见肝脏淤血、肿大，周边钝圆等病理变化，生理盐水组小鼠无任何明显的病理变化。

2.5 药敏试验 在所用的15种药敏纸片中，分离菌株LPSM对卡那霉素、链霉素、林可霉素耐药，而分离菌株FMDD_5对青霉素、卡那霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星、林可霉素耐药。

2.6 分子进化分析 采用邻近法将8株解没食子酸链球菌解没食子酸亚种和11株解没食子酸链球菌马其顿亚种与2株分离菌株进行建树，建树结果见图1。肝脏分离株FMDD_5与其他8株解没食子酸链球菌解没食子酸亚种同属一个大的分支，保守性比较高，基因序列相似性高达99.9%。肺脏分离菌株LPSM与其他11株解没食子酸链球菌马其顿亚种处于不同的分支，其相似性达99.72%。

图1 21株解没食子酸链球菌进化分析

3 讨论

目前，国内外对麝类的研究主要集中于野生麝类资源的保护、麝的人工养殖技术以及麝香的开发方面[8-9]，关于麝的化脓性疾病的研究相对较少。而化脓性疾病在麝养殖过程中发病率比较高，约占麝疾病的70%，严重制约麝养殖业的健康发展[10]。加大对麝化脓性疾病的研究，是促进人工养麝的重要途径。解没食子酸链球菌作为一种人兽共患病病原，已经在鸡、鸭、鹅、野生亚洲象等动物机体内分离到该致病菌[11]。李美霞等[12]对解没食子酸链球菌不同感染途径雏鸭的病理变化进行比较发现，不同途径感染的雏鸭均有较高死亡率，表现出严重的心肌炎、脑膜炎等病理变化。解没食子酸亚种一直被认为是正常菌群，存在于人类肠道[2]。越来越多的研究证实，解没食子酸亚种是机会性致病菌，在人临床研究发现，能引起心内膜炎和败血症等多种感染，Sillanp等[13]研究证实，链球菌引起的人感染性心内膜炎约24%的都是由解没食子酸亚种引起。而在养殖业中，解没食子酸亚种能够引起动物感染乳腺炎、败血症等[14]。目前普遍认为马其顿亚种不具备毒性，是安全的。

本试验对病死林麝进行剖检证实，解没食子酸亚种和马其顿亚种均能够引起林麝的化脓性疾病，小鼠致病性试验中，实验室分离菌株解没食子酸亚种FMDD_5和马其顿亚种LPSM均能够引起小鼠肝脏的病理变化。耐药性试验表明，解没食子酸亚种和马其顿亚种对多类抗生素都出现耐药性，所以在临床用药中应严格把控抗生素的使用。由于与马其顿亚种具有较高同源性的菌株均表现出致病性，因此将马其顿亚种应用于食品中还应该进行严格防范。

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Isolation,IdentificationandBioinformaticsAnalysisofStreptococcusgallolyticus

JIANG Jun-qing1， CHENG Jian-guo1， ZHAO Wei2, LUO Yan1， WANG Wu-you2, TIAN Qing2

(1 Sichuan Institute of Musk Deer Breeding, Dujiangyan 611830, China ;2 College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China)

Pathogens were isolated and identified by conventional method and 16S rRNA sequence analysis from suppurative disease of two forest musk deer in Sichuan. The pathogenicity of the isolates was verified by pathogenicity tests in mice, and antimicrobial susceptibility was evaluated by disk diffusion test (K-B method). In order to establish the phylogenetic relationship of the isolates, the phylogenetic tree of the isolates was constructed. The results showed that oneS.gallolyticussubsp.gallolyticusstrain and oneS.gallolyticussubsp.macedonicusstrain were isolated and identified,and both the isolates caused hepatomegaly in BALB/c mice.Multiple antibiotic resistances were observed in the phenotypic analysis. Furthermore, the phylogenetic analysis of the two isolates showed that they were segregated in different branches.

forest musk deer ;Streptococcusgallolyticus; isolation and identification ; phylogenetic analysis

LUO Yan

Q93-331

A

0529-6005(2017)10-0020-03

2017-04-12

四川省省级科研院所科技成果转化资金项目(2017YSZH0008)

姜俊庆(1961-)，男，助理研究员，本科，主要从事经济动物研究，E-mail：419332680@qq.com

罗燕，E-mail：lycjg@163.com