玉米单籽粒及单穗籽粒直链淀粉质量分数NIRS模型的建立与验证

刘林三，张 宏，冯娇娇，钟雨越，张旭东， 李艺博，徐淑兔，薛吉全， 郭东伟

(1.西北农林科技大学 农业部西北旱区玉米生物学与遗传育种重点实验室，陕西杨凌 712100; 2.陕西省玉米工程技术研究中心，陕西杨凌 712100; 3.杨凌职业技术学院 水利工程学院,陕西杨凌 712100)

玉米单籽粒及单穗籽粒直链淀粉质量分数NIRS模型的建立与验证

刘林三1,2，张 宏3，冯娇娇1,2，钟雨越1,2，张旭东1,2， 李艺博1,2，徐淑兔1,2，薛吉全1,2， 郭东伟1,2

(1.西北农林科技大学 农业部西北旱区玉米生物学与遗传育种重点实验室，陕西杨凌 712100; 2.陕西省玉米工程技术研究中心，陕西杨凌 712100; 3.杨凌职业技术学院 水利工程学院,陕西杨凌 712100)

玉米；单籽粒；直链淀粉质量分数；近红外光谱；子模型

玉米淀粉是重要的工业原料，以淀粉为原料的工业制成品超过2 000种[1]。普通玉米淀粉由70%～75%的支链淀粉和25%～30%的直链淀粉组成，淀粉的直支比显著影响着淀粉的用途和加工特性[2-3]。高直链淀粉是指直链淀粉质量分数超50%的淀粉，其理化、结构及热特性与普通淀粉存在很大差异，从而具有普通淀粉所不具备的特殊用途，广泛用于环保、医药、食品、纺织等领域[4-5]。

玉米籽粒淀粉的高直链特性是受1对隐性等位突变基因ae(amylose extender)控制，该基因的存在降低淀粉分支酶SBEⅡb的活性，使淀粉中积累更多的直链淀粉，ae基因与不同的基因互作会产生不同的遗传效应[6-7]。因此，为了培育更具工业价值的直链淀粉质量分数超过70%的玉米杂交组合，就需要在高直链玉米自交系与不同遗传背景材料的杂交、自交早代群体中进行大规模籽粒直链淀粉质量分数测定，因此，建立一套快速、准确、无损伤的籽粒直链淀粉质量分数测定方法就成为高直链玉米新品种选育的重要技术环节。

目前国际上常用的测定籽粒直链淀粉质量分数的方法主要有碘显色光度法和碘亲和力测定法(包括安倍滴定法和电位滴定法)[8-9]，但这2种方法不仅费时费力，成本高，而且会破坏优良的籽粒，尤其不利于对早代单个籽粒直链淀粉质量分数的测定。近红外反射光谱技术(NIRS)以样本内的有机基团反射的光谱数据的特征为基础来标定样本内部有机成分的组成，它是近年来快速兴起的一种样本无损伤快速测定技术，已广泛应用于科研、制造、仓储等领域的成分测定和质量控制[10-11]，成为国内外小麦、谷子、玉米和水稻等农作物籽粒品质分析的重要手段[12-13]，用于测定水分、总淀粉、粗纤维、蛋白质、氨基酸等基本成分[14-16]。利用近红外反射光谱技术测定玉米籽粒直链淀粉质量分数的研究在国内外已有多篇报道[17-19]，但这些研究均用于稳定品种籽粒直链淀粉质量分数的测定，缺少早代单籽粒直链淀粉质量分数近红外测定的模型，同时由于近红外仪器和建模样本来源的差异，建立的模型往往通用性较差，因此，急需建立立足于本地材料及设备条件的直链淀粉NIRS模型，以满足高直链淀粉玉米育种的需要。

此外，在建模过程中，参与建模样品的化学值变异范围大，建立的模型适用范围广，但测定准确度会下降，因此，模型测定的可靠性和稳定性之间总是存在矛盾[20-22]，如何兼顾可靠性和适用性的问题尤其值得思考；而在实际建模的过程中，在保证模型一定稳定性的前提下，通过建立化学值变异范围相对较小的模型来提高模型的预测准确度[20]或许是个有效的选择。基于上述问题和假设，本研究分别以课题组自育的高直链淀粉玉米材料为对象，首先建立化学值变异范围较大的单穗NIRS模型，在此基础上将建模样品化学值变异区间分割为2个子区间，利用2个子区间的建模样品分别建模，形成1个“总模型”和2个“子模型”。依据各模型实际预测效果比较“子模型”和“总模型”的可靠性，以检验利用“子模型”提高预测准确度的可行性。同时，再选用F2自交后代单籽粒为材料建立单籽粒直链淀粉质量分数测定模型，以期为高直链淀粉玉米新品种的选育提供便利，并为相关研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试的玉米籽粒材料由笔者课题组提供，其中单籽粒材料共196份，从F2代单穗籽粒中随机选择所得，粒型、颜色不一；单穗籽粒材料360份，均为全穗籽粒，包含自交系和杂交种，且材料间粒型、大小及收获年份有所差异。

1.2 方 法

1.2.1 样品光谱采集 在采集光谱之前，所有材料室温下平衡水分60 d。以参与建模样本逐一编号后，分别装入小样品盘和单籽粒镜面样品盘，近红外光谱仪(DA7200，Perten，Sweden)进行全光谱扫描，采集光谱数据，谱区范围950～1 650 nm，分辨率5 nm。每个样品重复装样3次，每次装样扫描2次，保存光谱。在单籽粒光谱采集时，籽粒需水平放置在样品盘中心，无胚一侧朝上。

1.2.2 玉米籽粒直链淀粉质量分数的化学法测定及建模样品的筛选 参照李志伟等[23]的方法分别提取单籽粒及单穗样本(30粒混合)总淀粉，双波长碘比色法[24]测定直链淀粉质量分数，测定波长分别为620 nm和510 nm，样品按化学测定值从小到大排列并由低到高每3个样品取 1 个分别组成验证集，其余样品分别组成校正集[25]。其中单穗籽粒样品校正集和验证集的分布频率分别见图1-A和图1-B，根据校正集化学值变异区间及样品分布频率，选择以45%为分界线将校正集平分为2个子校正集，以使2组样品化学值变幅相近且每一组各不同直链淀粉质量分数个体出现的频率符合正态分布，用于建立2个子模型，同时验证集也相应平分为2个子验证集。测定结果均以干基(%)表示，所有被测样品均平行测定2次并取平均值，2次测定数值相对误差不得超过2%。

图1 单穗籽粒样品校正集和验证集样品的分布频率Fig.1 Distribution frequency of the calibration and validation sets of single spike grain samples

2 结果与分析

2.1 供试样品的近红外光谱

以DA7200型近红外光谱分析仪扫描包含校正集和验证集在内的196份单籽粒样品(图2-A)和360份单穗籽粒样品(图2-B)得到的近红外光谱。去除部分离散性大的异常光谱后，所有样品的近红外光谱呈现相似的曲线线型，在1 000、1 200、1 380及1 470 nm附近有明显的吸收峰。但单籽粒样品光谱和单穗样品光谱之间存在明显的光谱基线差异，这可能是装样量的不同导致的；同时，两光谱图内部的部分样品光谱也发生基线漂移及非均匀变化。用一阶导数+SNV的数学方法对光谱数据进行预处理后得到单籽粒预处理光谱(图2-C)和单穗预处理光谱(图2-D)，上述误差基本得以消除。各图谱一致的曲线线型表明样本基本成分相对一致，单个样本间的光谱值差异则表明样本各成分质量分数在一定范围内波动。

图2 单籽粒样品与单穗籽粒样品的近红外光谱及其预处理光谱Fig.2 Spectra and preprocessed spectra of near infrared reflectance spectroscopy of single-kernel and single-spike samples

2.2 供试样品直链淀粉质量分数的化学值

根据GH值及Y残差，设置GH=4，Y=10.0，剔除校正集中部分参试样品，并利用交叉验证处理技术去除离散性大的样品，各校正集中实际参与建模的单籽粒和单穗籽粒样品直链淀粉质量分数的化学测定结果见表1。实际参与建模的137份单籽粒校正集样品和251份校正集单穗样品的直链淀粉质量分数变幅分别为25.25%～51.65%和27.20%～62.50%，标准偏差分别为4.50%和8.81%，样品间变异系数分别为13.8%和20.9%，样品化学值变幅较大，变异程度较高，基本覆盖早代单籽粒和单穗籽粒可能出现的直链淀粉质量分数变化范围，满足建立NIRS模型并做验证的条件。单籽粒样品校正集和验证集用于单籽粒NIRS模型的校正与验证，单穗籽粒样品校正集和验证集用于单穗NIRS模型的校正与验证。

2.3 单穗籽粒样品子集的划分

根据图1单穗籽粒样品化学值的变异范围和分布频率，将单穗籽粒样品的校正集和验证集分别划分为2个子集，设置GH=4，Y=10.0，剔除部分异常样品后实际参与子模型校正与验证的样品划分结果见表2。子校正集一、二的样品化学值变幅分别为27.20%～45.00%和45.20%～62.50%，标准偏差分别为4.38%和3.59%，样品间变异系数分别为12.3%和7.0%，基本满足本试验对于建立单穗NIRS子模型的要求。子校正集一和子验证集一用于单穗NIRS子模型一的校正与验证，子校正集二和子验证集二用于单穗NIRS子模型二的校正与验证。

表1 参与建模的单籽粒和单穗籽粒样品直链淀粉质量分数的化学测定结果Table 1 Chemical analysis results of single-kernel and single-spike samples participating the modeling

表2 参与建模的单穗籽粒样品子集划分结果Table 2 Subset division results of single-spike samples participating the modeling

2.4 NIRS模型的建立与优化

2.5 NIRS模型的实际预测效果分析

表3 各NIRS模型的校正与外部验证结果Table 3 Calibration and validation results of NIRS models

图3 各NIRS模型的外部验证结果Fig.3 External validation results of NIRS models

以上结果表明，单籽粒NIRS模型定标效果良好，预测准确度高，可用于玉米单籽粒直链淀粉质量分数的鉴定。单穗NIRS子模型一、子模型二的RMSECV(2.394，2.408)(图2)和RMSEP(2.369，2.596)均明显小于单穗NIRS模型(RMSECV3.370，RMSEP3.205)，可见单穗NIRS子模型的预测准确度高于单穗NIRS模型。

3 讨 论

建立NIRS模型时，对于建模样品在化学值变化范围内的分布状态，是遵循均匀分布还是正态分布好，在近红外分析界存在一定的争议[21]。严衍禄等[20]认为样品按照自然的正态分布比较好，而褚小立等[28]则认为样品应该均匀分布。李军会等[29]以云南优质烤烟为试验材料，对样品均匀分布和正态分布对NIRS建模结果的影响做了初步研究，结果显示，当建模样品数分别为25、40和55时，正态分布模型和均匀分布模型的平均测量误差分别为1.32%和3.09%、1.67%和2.00%及1.42%和1.83%，表明建模样品量较少时，正态分布模型是优于均匀分布模型的。但随着建模样品的增多，均匀分布模型与正态分布模型测量误差的差距呈现缩小趋势。受样品丰富度的限制，本研究中单穗模型的建模样品分布状态不佳，但由于其建模样品数在200以上，子模型的建模样品数也均接近或大于100，建模样品数足够多，样品分布状态对模型的影响可以不予考虑。

为提高模型预测的稳定性，扩大模型适用范围，本研究选用多种粒型、颜色的单籽粒样本构建单籽粒NIRS模型，样品直链淀粉质量分数变异范围为25.25%～51.65%；选用粒型、颜色、大小各有差异的自交系和杂交种单穗籽粒构建单穗NIRS模型及其子模型，样品直链淀粉质量分数变异范围为27.20%～62.50%。然而，模型预测稳定性的增加往往伴随着可靠性的降低[20-21]，这也是单籽粒NIRS模型和单穗籽粒NIRS模型预测准确度尚有提升空间的重要原因。通过缩小样品目标化学值变异范围建立的单穗NIRS子模型具备更好的预测效果，这印证了上述观点。另外，单穗NIRS子模型的校正结果(表3)显示，RPDlt;2，这与子校正集样品间较小的变异范围和变异程度(CVlt;13%，见表2)有关。

在建立近红外数学模型的过程中，建模样品的含水量、温度、颗粒大小及均匀性、松紧程度等因素都会对采集光谱产生影响。因此,在建模过程中，应尽量将样品含水量、温度和均匀性等因素控制在一致水平，规范装样条件(样品松紧度、高度等)[30]，充分利用建模软件自身的筛选功能和评价方法剔除异常光谱，并采用适当的光谱预处理方法对光谱数据进行预处理。在本研究中，所有参试样品均经过2个月以上的平衡水分处理，装样条件保持一致，根据GH值、Y残差对校正集样品光谱进行异常值检验，并采用一阶导数+SNV的光谱预处理方法对光谱数据进行预处理，这在一定程度上降低了非目标因素对建模效果的影响。

4 结 论

本研究应用近红外光谱技术(NIRS)分别构建单籽粒和单穗籽粒直链淀粉质量分数的NIRS分析模型，并通过分割建模样品化学值变异范围的方法建立2个单穗NIRS子模型。所建单籽粒NIRS模型的定标效果良好，实际预测准确度较高，可用于早代单籽粒直链淀粉质量分数的鉴定。单穗NIRS子模型较高的预测准确度可以弥补单穗NIRS模型可靠性的不足，在鉴定单穗籽粒直链淀粉质量分数的过程中，可采用单穗NIRS模型+子模型的联合鉴定方法，即先用单穗NIRS模型对待测样品初步鉴定，然后利用相应的子模型进一步鉴定，以获得准确度更高的鉴定结果。

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CorrespondingauthorZHANG Hong,female,associate professor. Research area: mathematical model design.E-mail:zhanghong@ylvtc.com GUO Dongwei,male,associate professor.Research area: maize genetics and breeding. E-mail: gdwei1973@126.com

(责任编辑：潘学燕Responsibleeditor:PANXueyan)

TheCalibrationandValidationofNIRSPredictionModelsforAmyloseMassFractionofSingle-kernelandSingle-spikeofMaize

LIU Linsan1,2,ZHANG Hong3,FENG Jiaojiao1,2,ZHONG Yuyue1,2,ZHANG Xudong1,2, LI Yibo1,2,XU Shutu1,2,XUE Jiquan1,2and GUO Dongwei1,2

(1.Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Maize in Arid Area of Northwest Region,Ministry of Agriculture,College of Agronomy,Northwest Aamp;F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.Maize Engineering amp; Technology Research Center of Shaanxi Province,Yangling Shaanxi 712100,China; 3.College of Water Conservancy Engineering,Yangling Vocational amp; Technical College,Yangling Shaanxi 712100,China)

Maize; Single kernel;Amylose mass fraction;Near infrared spectroscopy: Sub-model

2016-08-06

2016-09-26

Yangling Demonstration District Science and Technology Plan Projects(No.2014NY-01)；Cyrus Tang Breeding Fund.

LIU Linsan,male,master student.Research area:maize genetics and breeding.E-mail:liuls1993@163.com

日期：2017-11-17

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.014.html

2016-08-06

2016-09-26

杨凌示范区科技计划项目(2014NY-01)；唐仲英育种基金。

刘林三，男，硕士研究生，从事玉米遗传育种研究。E-mail:liuls1993@163.com

张 宏，女，副教授，主要从事数理模型设计研究。E-mail：zhanghong@ylvtc.com 郭东伟，男，副教授，主要从事玉米遗传育种研究。E-mail: gdwei1973@126.com

O657.33

A

1004-1389(2017)11-1606-08