响应曲面法优化野菊花中总黄酮的超声提取工艺

崔建强，赖普辉

(陕西国际商贸学院医药学院,陕西 西安 710246)

响应曲面法优化野菊花中总黄酮的超声提取工艺

崔建强，赖普辉

(陕西国际商贸学院医药学院,陕西 西安 710246)

以总黄酮得率为评价指标，采用单因素实验和响应曲面法实验优化野菊花中总黄酮超声提取工艺。确定最佳提取工艺为：乙醇体积分数60%、超声提取时间40 min、液料比15∶1(mL∶g)、超声提取温度50 ℃、超声功率1 080 W，在此条件下，总黄酮得率可达0.881%。该提取工艺设计合理，为进一步研究野菊花中总黄酮的应用提供了科学依据。

总黄酮；超声波；响应曲面法

野菊花(Chrysanthemumindicum)是菊科植物野菊花的干燥头状花序，在我国分布广泛[1]。其内含有大量的黄酮类化合物，黄酮类化合物具有多种药理活性，如清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能[2-3]。超声提取工艺是一种新型提取方法，具有能耗低、效率高、不破坏有效成分等特点[4]。作者在单因素实验的基础上，以总黄酮得率为评价指标，通过响应曲面法优化野菊花中总黄酮的超声提取工艺，拟为研究野菊花中总黄酮的应用提供科学依据。

1 实验

1.1材料、试剂与仪器

野菊花，购于西安万寿路中药材市场。

芦丁标准品、无水乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；石油醚，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；蒸馏水，自制；5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液、4%氢氧化钠溶液，分析纯，上海友思生物技术公司。

智能型电热恒温鼓风干燥箱，上海琅玕实验设备有限公司；低温恒温箱、多用途恒温超声波提取机，无锡德谱仪器制造有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；GY-753型粉碎机，天津泰斯特仪器有限责任公司；紫外可见分光光度计，上海圣科仪器设备有限公司。

1.2野菊花预处理

挑选品质优良的野菊花在80 ℃干燥5 h，用粉碎机粉碎成细粉，过60目筛。精密称取野菊花粉末5 g，置于100 mL圆底烧瓶中，加入50 mL石油醚于70 ℃水浴锅中回流3 h，除去脂肪。

1.3 总黄酮得率的测定

1.3.1 芦丁标准溶液的配制

精密称取芦丁标准品5 mg，加入甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，即得到浓度为0.2 mg·mL-1的芦丁标准溶液。

1.3.2 检测波长的确定

取芦丁标准溶液，在400～600 nm范围内全波长扫描。结果发现，芦丁标准品在510 nm处出现最大吸收峰。因此，以510 nm作为检测波长[5]。

1.3.3 标准曲线的绘制

分别精密吸取芦丁标准溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于25 mL容量瓶中，加蒸馏水至6 mL，加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min；加入1 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min；加入10 mL 4%氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15 min。用紫外可见分光光度计在510 nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标、芦丁标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。拟合线性回归方程为y=13.209x+0.2418，R2=0.9912，线性范围为8～40 μg·mL-1。

1.3.4 总黄酮得率的计算

称取预处理过的野菊花粉末5 g，超声提取得到一定量的浸膏。将浸膏用无水乙醇溶解定容在V1容量瓶中，稀释一定倍数，按1.3.3方法测定510 nm处吸光度，按下式计算总黄酮得率。

式中：W0为总黄酮含量,mg·mL-1；V1为样液总体积，mL；W为野菊花粉末质量，g;N为稀释倍数。

1.4 提取工艺优化

1.4.1 单因素实验

分别称取野菊花粉末5 g，在保持其它条件不变的情况下进行超声提取，依次考察超声提取时间(30 min、40 min、50 min、60 min)、超声提取温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1，mL∶g)、乙醇体积分数(20%、40%、60%、80%)、超声功率(720 W、900 W、1 080 W、1 260 W)5个因素对总黄铜得率的影响。

1.4.2 响应曲面法实验

依据单因素实验结果，找出对总黄酮得率影响最大的4个因素，采用Box-Behnken实验设计3个水平进行响应曲面法实验，根据响应曲面构建的三维图确定最佳超声提取工艺。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果(图1)

图1 单因素实验结果Fig.1 Results of single-factor experiment

从图1可以看出，超声功率(图1c)对总黄酮得率的影响最小，当超声功率为1 080 W时，总黄酮得率最大。原因可能是，当超声功率增大时，超声波强度会使空化阀逐渐升压，产生空化作用，当空化作用最强时提取率最佳；当超声功率超过空化阀升压后，会产生反作用，使提取率降低。因此考虑到高效、节能，选择1 080 W为最佳超声功率。其它4个因素通过响应曲面法优化。

2.2 响应曲面法实验结果

2.2.1 实验设计

根据单因素实验结果，选取乙醇体积分数、超声提取时间、液料比、超声提取温度作为自变量，以总黄酮得率为响应值，通过Box-Behnken实验设计，构建三维数学模型优化总黄酮的超声提取工艺[6-8]。实验的因素与水平见表1，响应曲面法实验结果见表2。

表1实验的因素与水平

Tab.1Factors and levels of experiment

表2响应曲面法实验结果

Tab.2Results of response surface methodology experiment

2.2.2 数学模型的建立及显著性检验结果

通过Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行二次多项式的回归方程拟合，得到回归方程模型为：Y=0.86-0.034A+7.712×10-3B+0.021C-5.291×10-3D+0.017AB-0.015AC+0.021AD-7.500×10-4BC-0.051BD+0.021CD-0.093A2-0.12B2-0.077C2-0.12D2(R2=0.9227，Plt;0.0001)。通过采用响应面的ANOVA来进行回归参数分析，检验回归方程模型和各项参数的显著性,结果如表3所示。

表3响应面回归模型的方差分析

Tab.3Variance analysis of regression equation model for response surface

注：***表示Plt;0.0001，差异极显著；**表示Plt;0.01，差异较显著；*表示Plt;0.05，差异显著。

2.2.3 交互作用的分析和优化

乙醇体积分数、超声提取时间、液料比和超声提取温度4个实验参数两两交互作用对总黄酮得率影响的趋势图如图2所示。

从图2a可以看出，超声提取时间的坡面比乙醇体积分数的坡面平缓，说明乙醇体积分数对总黄酮得率影响较为显著；二者等高线图趋于圆形，说明二者交互作用对总黄酮得率无显著影响，由等高线可以确定的最佳参数为：乙醇体积分数60%，超声提取时间40 min。

从图2b可以看出，液料比的坡面比乙醇体积分数的坡面平缓，说明乙醇体积分数对总黄酮得率影响较为显著；二者等高线图趋于圆形，说明二者交互作用对总黄酮得率无显著影响，由等高线可以确定的最佳参数为：乙醇体积分数60%，液料比15∶1。

由图2c可以看出，超声提取温度的坡面比乙醇体积分数的坡面平缓，说明乙醇体积分数对总黄酮得率影响相对较为显著；二者等高线图趋于椭圆形，说明二者交互作用对总黄酮得率有显著影响，由等高线图可以确定的最佳参数为：乙醇体积分数60%，超声提取温度50 ℃。

由图2d可以看出，液料比的坡面比超声提取时间的坡面陡峭，说明液料比对总黄酮得率影响相对较为显著；二者等高线趋于圆形，说明二者交互作用对总黄酮得率无显著影响，由等高线图可以确定的最佳参数为：液料比15∶1,超声提取时间40 min。

由图2e可以看出，超声提取时间的坡面比超声提取温度的坡面陡峭，说明超声提取时间对总黄酮得率影响相对显著；二者等高线图趋于椭圆形，说明二者交互作用对总黄酮得率有显著影响，由等高线图可以确定的最佳参数为：超声提取温度50 ℃，超声提取时间40 min。

由图2f可以看出,液料比的坡面比超声提取温度的坡面陡峭，说明液料比对总黄酮得率有显著影响；二者等高线图趋于椭圆形，说明二者交互作用对总黄酮得率有显著影响，由等高线图可以确定的最佳参数为：液料比15∶1,超声提取温度50 ℃。

由响应曲面图可得出最佳提取工艺为：乙醇体积分数60%，超声提取时间40 min，液料比15∶1，超声提取温度50 ℃。

图2 等高线图和三维图 Fig.2 The contour map and the response surface map

2.2.4 回归模型验证

从2.2.3响应曲面的图形可以看出有最大的响应值，通过软件分析，预测最佳提取工艺为：乙醇体积分数60%、超声提取时间40 min、液料比15∶1(mL∶g)、超声提取温度50 ℃、超声功率1 080 W，在此条件下，进行3次验证实验，总黄酮平均得率为0.881%，与预测值相符。表明该模型设计合理。

3 结论

通过单因素实验和响应曲面法实验确定超声提取野菊花中总黄酮的最佳工艺为：乙醇体积分数60%、超声提取时间40 min、液料比15∶1(mL∶g)、超声提取温度50 ℃、超声功率1 080 W。对该工艺参数进行了验证，总黄酮得率为0.881%。该提取工艺设计合理，为进一步研究野菊花中总黄酮的应用提供了科学依据。

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[3] 陈传千，沈艳平，屈跃丹，等.野菊花提取物药理作用的研究进展[J].吉林医药学院学报，2010,31(3)：175-178.

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OptimizationinUltrasonicExtractionofTotalFlavonoidsinChrysanthemumindicumbyResponseSurfaceMethodology

CUI Jian-qiang，LAI Pu-hui

(SchoolofMedicine,ShaanxiInstituteofInternationalTradeamp;Commerce，Xi′an710246，China)

Using total flavonoids yield as an evaluation index,we optimized the extraction process of total flavonoids fromChrysanthemumindicumby a single-factor experiment and a response surface methodology.The optimum extraction process could be determined as follows:ethanol volume fraction of 60%,ultrasonic extraction time of 40 min,extraction temperature of 50 ℃,liquid-solid ratio of 15∶1(mL∶g),and ultrasonic power of 1 080 W.Under above conditions,the total flavonoids yield reached 0.881%.The extraction process is designed rationally,which provides a scientific basis for the further research on the application of total flavonoids fromChrysanthemumindicum.

total flavonoids；ultrasound；response surface methodology

陕西国际商贸学院科研项目(SMXY201715)

2017-07-07

崔建强(1979-)，男，陕西西安人，讲师，研究方向：药物分析化学，E-mail:1030287236@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.008

崔建强,赖普辉.响应曲面法优化野菊花中总黄酮的超声提取工艺[J].化学与生物工程，2017，34(11)：30-34，48.

TQ461

A

1672-5425(2017)11-0030-05