甘草黄酮的提取分离及其葡萄糖苷酶抑制活性研究

杨剑萍，苏婷婷，张韩洁，林晓纯，刘小意，黄 灏，汪雅丽

(广东第二师范学院化学系，广东 广州 510303)

甘草黄酮的提取分离及其葡萄糖苷酶抑制活性研究

杨剑萍，苏婷婷，张韩洁，林晓纯，刘小意，黄 灏，汪雅丽

(广东第二师范学院化学系，广东 广州 510303)

采用超声提取和碱溶酸沉法提取甘草的活性成分甘草黄酮；通过化学显色法进行定性鉴定，采用分光光度法测定甘草黄酮含量；并建立了一种基于电化学法的葡萄糖苷酶抑制活性筛选新方法，以临床降糖药阿卡波糖验证了电化学筛选法的可靠性。结果表明，甘草黄酮具有较好的葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50为67.6 mg·L-1。葡萄糖苷酶抑制活性电化学筛选法具有良好的准确性和抗干扰能力，为中药葡萄糖苷酶抑制剂的研发提供了有价值的参考。

甘草黄酮；葡萄糖苷酶抑制活性；电化学法；酶抑制剂

甘草是多年生豆科草本植物，是我国传统的补益中药，有效成分主要为甘草黄酮、甘草酸和甘草多糖。文献报道，甘草黄酮具有良好的抗氧化、抗病毒、止咳平喘、调和诸药等生理活性[1-2]，但有关甘草黄酮的葡萄糖苷酶抑制活性尚不明确。

我国天然药物资源丰富，采用中药治疗糖尿病已有多年的临床实践；此外，中药的毒副作用相对较小且疗效显著，从天然药物中筛选葡萄糖苷酶抑制药物具有广阔的应用前景[3-4]。目前，药物葡萄糖苷酶抑制活性筛选常采用碘量法和分光光度法，容易受溶液背景颜色的干扰从而造成实验误差大。由于中药提取物大部分具有较深的颜色，不可避免会影响实验结果[5]。因此，开发一种筛选中药葡萄糖苷酶抑制活性的新方法很有必要。作者采用超声提取和碱溶酸沉法提取甘草黄酮，建立了一种适用于天然药物有效成分的葡萄糖苷酶抑制剂快速筛选的电化学法，并对电化学筛选法的可靠性和抗干扰性进行了研究。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

甘草，大森林药店，粉碎过四号筛。

α-葡萄糖苷酶、葡萄糖、淀粉，上海伯奥生物科技有限公司；阿卡波糖(每片含阿卡波糖50 mg)，德国拜耳公司；芦丁标准品，上海伊卡生物技术有限公司；硝酸铜，分析纯，广州试剂厂。

TU-1900型紫外可见分光光度计，北京普析仪器公司；CS电化学工作站，武汉科恩特仪器有限公司；玻碳电极、Ag/AgCl电极和铂丝电极。

1.2 甘草黄酮的提取分离

称取甘草粉末50 g于烧杯中，加入500 mL 95%乙醇溶液浸渍过夜，置于超声波清洗器中提取1 h，过滤。滤液减压浓缩成浸膏状，然后加5% Na2CO3溶液溶解，再加入浓盐酸调至pH值为1～2，甘草黄酮沉淀析出，抽滤。重复2次碱溶酸沉过程，干燥，得到较纯的甘草黄酮提取物[6]。

1.3 甘草黄酮提取物的定性鉴定

取少量提取物溶于1 mL乙醇中，撒一点镁粉，滴加2滴浓盐酸，观察颜色变化。用玻璃棒蘸取提取液于滤纸上，干燥后喷洒1%乙酸镁甲醇溶液，置于紫外光下观察。

1.4 甘草黄酮含量的测定

称取芦丁标准品10 mg，用50%乙醇溶解，定容到50 mL容量瓶中，配成浓度为0.20 g·L-1芦丁标准溶液。分别吸取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL芦丁标准溶液于10 mL容量瓶中，加50%乙醇定容到5 mL，加5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；加10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；加4%NaOH溶液2 mL，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置15 min，于510 nm处测吸光度。

称取甘草黄酮提取物40.0 mg，用50%乙醇溶解，定容到50 mL容量瓶中，准确移取1 mL溶液至10 mL容量瓶中，同法测定溶液吸光度，计算甘草黄酮含量。

1.5 葡萄糖浓度的电化学法测定

以沉积了氧化铜的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl电极为参比电极，构成一个简便的电化学安培传感器用于测定葡萄糖浓度。电沉积方法如下：在0.1 mol·L-1Cu(NO3)2(0.1 mol·L-1KCl作为支持电解质)溶液中对玻碳电极进行电沉积。恒电位极化电位为-0.4 V，时间为3 min，常温下晾干；电位设为-0.5～0.3 V，在0.1 mol·L-1NaOH溶液里循环伏安循环20圈，得到沉积了氧化铜的玻碳电极[7]。

循环伏安的检测条件：电解质溶液为0.1 mol·L-1NaOH溶液，电位范围为0～0.8 V，扫描速率为100 mV·s-1，电流量程为20 mA，检测葡萄糖浓度为0.005 mol·L-1。电流与葡萄糖浓度的标准曲线测定条件：在不断磁力搅拌下滴加葡萄糖标准溶液，电位设为0.6 V，葡萄糖浓度在1 000 s内从0.1 mmol·L-1到10 mmol·L-1，每个浓度检测3次[8]。

1.6 葡萄糖苷酶抑制活性实验

1.6.1 酶液的配制

称取α-葡萄糖苷酶16.0 mg置于50 mL烧杯中，加入0.1 mol·L-1pH值6.8的磷酸钠缓冲溶液30 mL，搅拌溶解后将上清液转移到100 mL容量瓶中，用磷酸钠缓冲溶液定容至刻度，摇匀，配成浓度为5 U·mL-1的酶液。置于4 ℃冰箱内静置过夜，过滤，移取0.2 mL滤液于10 mL容量瓶中，用磷酸钠缓冲溶液定容至刻度，摇匀，配成浓度为0.1 U·mL-1的酶液。

1.6.2 淀粉溶液的配制

称取2.0 g淀粉，加蒸馏水溶解，边搅拌边加入约80 mL热水，煮沸3 min，静置冷却过滤至100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，配成浓度为2.0%淀粉溶液。

1.6.3 酶抑制活性的测定

6支试管分别标号a、b、c、d、e、f ，其中a为空白组，不加酶也不加阿卡波糖；b为阴性对照组，加酶不加阿卡波糖；c为阳性对照组，加酶、加0.1 mL阿卡波糖；d、e、f为样品组，加酶、加不同浓度的甘草黄酮提取物溶液。试剂加入的顺序为：pH值6.8的磷酸钠缓冲溶液2.5 mL，酶液0.5 mL(空白组加0.5 mL磷酸钠缓冲溶液)，0.1 mL阿卡波糖，置于37 ℃水浴10 min，再加入5 mL 2.0%淀粉溶液，37 ℃水浴中恒温20 min，加入6 mL 0.5 mol·L-1NaOH溶液终止反应。迅速冷却至室温，蒸馏水定容至30 mL，分别检测各反应体系的葡萄糖浓度。按下式计算酶抑制率(I)：

式中：b为阴性对照组葡萄糖浓度；d为样品组葡萄糖浓度；a为空白组葡萄糖浓度。

2 结果与讨论

2.1 提取物的定性分析

提取物遇镁粉和浓盐酸出现红色；再喷洒乙酸镁溶液，在紫外光下可观察到荧光，这是黄酮类物质特有的显色反应，可判断提取物为黄酮类物质。

2.2 甘草黄酮含量的测定

芦丁标准溶液浓度与吸光度的关系见表1。

表1芦丁标准溶液浓度与吸光度的关系

Tab.1Correlation between the concentration ofrutin standard solution and absorbance

测定甘草黄酮样品溶液吸光度为0.685，查得浓度为69.0 mg·L-1，经计算提取物中甘草黄酮含量为86.50%。

2.3 电化学法测定葡萄糖浓度

葡萄糖的循环伏安曲线及响应电流与葡萄糖浓度的线性曲线如图1所示。

从图1a可以看出，电极在氢氧化钠溶液中没有明显的响应电流，添加了葡萄糖溶液后，氧化峰电流急增，并且在电位0.6 V处出现明显的葡萄糖氧化峰，循环伏安曲线证明了制备的电极对葡萄糖有良好的检测效果。从图1b可以看出，随着葡萄糖浓度的增加，响应电流也呈阶梯式上升，且在一定的浓度范围内，响应电流与葡萄糖浓度呈线性关系，线性方程为：y=139.1x+10，R2=0.9928。

2.4 葡萄糖苷酶抑制活性电化学筛选法的可靠性

采用临床降糖药α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖验证电化学筛选法的可靠性。电化学筛选法和碘量法测定阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率如表2所示。

图1 葡萄糖的循环伏安曲线(a)及响应电流与葡萄糖浓度的线性曲线(b)Fig.1 Cyclic voltammetry curve of glucose(a) and linear curve of current and glucose concentration(b)

表2阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率

Tab.2Inhibition rate of α-glucosaccharase by acarbose

从表2可以看出，2种方法测得的α-葡萄糖苷酶的抑制率比较接近，且在一定的浓度范围内，阿卡波糖浓度与抑制率呈正比。电化学筛选法和碘量法测得的半数抑制浓度(IC50)分别为42.2 mg·L-1和43.6 mg·L-1，表明阿卡波糖具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，与临床效果吻合，2种方法没有显著性差异。

2.5 电化学筛选法的抗干扰性研究

为验证葡萄糖苷酶抑制活性电化学筛选法的抗干扰性，加入酶抑制活性反应体系可能的干扰物质。分别往体系里添加反应浓度的磷酸盐缓冲溶液、淀粉、阿卡波糖、甘草黄酮、α-葡萄糖苷酶和葡萄糖溶液(5 mmol·L-1)，结果如图2所示。

从图2可以看出，电极只对葡萄糖具有很强的响应电流，而对干扰物没有明显的响应。表明电化学筛选法具有良好的抗干扰能力。

2.6 甘草黄酮的葡萄糖苷酶抑制活性研究

采用电化学法研究甘草黄酮的葡萄糖苷酶抑制活性，结果见表3。

图2 电化学筛选法的抗干扰性Fig.2 Anti-interference of electrochemical screening method

表3甘草黄酮的α-葡萄糖苷酶抑制率

Tab.3Inhibitionrateofα-glucosaccharasebylicoflavone

样品甘草黄酮浓度/(mg·L-1)抑制率/%空白组--阴性对照组--阳性对照组60.062.66样品组160.045.20样品组240.036.60样品组320.023.65

由表3可以看出，甘草黄酮具有一定的葡萄糖苷酶抑制活性，且在一定浓度范围内呈剂量依赖性。根据甘草黄酮浓度和抑制率的关系可以求出其对α-葡萄糖苷酶的IC50为67.6 mg·L-1，甘草黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制效果相当于阿卡波糖的72%。

3 结论

采用超声提取和碱溶酸沉法提取甘草黄酮，并测定其葡萄糖苷酶抑制活性，建立了中药活性成分的提取分离、定性鉴定和含量测定以及其葡萄糖苷酶抑制活性筛选的系统方法。结果表明，酶抑制活性电化学筛选法具有良好的准确性和选择性，甘草黄酮具有较好的葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50为67.6 mg·L-1。该电化学筛选法操作简单方便，为中药有效成分的葡萄糖苷酶抑制活性研究提供了一种新颖的研究方法。

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ExtractionandSeparationofLicoflavoneandItsInhibitoryActivityonGlucosaccharase

YANG Jian-ping，SU Ting-ting，ZHANG Han-jie，LIN Xiao-chun，LIU Xiao-yi,HUANG Hao，WANG Ya-li

(SchoolofChemistry，GuangdongUniversityofEducation，Guangzhou510303,China)

We extracted active constituent licoflavone fromRadixliquiritiaeusing ultrasonic extraction and alkali-soluble acid precipitation extraction methods.We qualitatively identified it by a chemical coloration method，and determined its content by spectrophotometry.Moreover,we established a new glucosaccharase inhibitor screening method based on an electrochemical amperometric method.And we demonstrated the reliability of electrochemical screening method by clinical hypoglycemic drug acarbose.The results show that the licoflavone has good glucosaccharase inhibitory activity and its IC50is 67.6 mg·L-1.The electrochemical screening method forα-glucosidase inhibition activity has high accuracy and anti-interference.This study provides a valuable reference for screening glucosaccharase inhibitor from Chinese tradition medicine.

licoflavone；glucosaccharase inhibitory activity；electrochemical method；enzyme inhibitor

广东省自然科学基金博士启动项目 (2015A030310202)，广东省教育厅强校工程青年创新人才类项目(2014KQNCX230)，广东第二师范学院博士专项经费项目(2013ARF04)，高等教育教学改革项目(2016ybzz08)，大学生创新训练项目(201714278005，201714278075)

2017-06-25

杨剑萍(1979-)，女，广东开平人，博士，讲师，研究方向：药物分析与药物筛选、分析化学新仪器新方法等，E-mail:yangjianping@gdei.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.004

杨剑萍，苏婷婷，张韩洁，等.甘草黄酮的提取分离及其葡萄糖苷酶抑制活性研究[J].化学与生物工程，2017，34(11)：15-18.

TQ461 R284.1

A

1672-5425(2017)11-0015-04