Th17细胞亚群在小鼠呼吸道合胞病毒感染后宿主免疫机制中的作用

李 燕 薛建芳

(包头市中心医院检验科，内蒙古 包头 014040)

Th17细胞亚群在小鼠呼吸道合胞病毒感染后宿主免疫机制中的作用

李 燕 薛建芳1

(包头市中心医院检验科，内蒙古 包头 014040)

目的探讨辅助性T淋巴细胞(Th)17在呼吸道合胞病毒(RSV)感染小鼠肺部炎症中的变化及其在RSV感染后宿主免疫机制中的作用。方法30只5周龄雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组各15只。对照组小鼠鼻腔滴入0.1 ml DMEM维持液(含有2.5%灭活的鸡血清)，实验组小鼠鼻腔滴入0.1 ml病毒液(TCID50为107.5/ml)。在处理后的第1、3、7天分别处死小鼠，取其外周血并留取小鼠脾脏和肺脏组织。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠外周血中白细胞介素(IL)-17A和IL-23p19的浓度。通过苏木素-伊红(HE)染色观察RSV感染后肺组织病理变化。通过流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞中Th17细胞亚群的含量变化。结果实验组小鼠在RSV病毒感染后1、3、7 d，血清IL-17A浓度较对照组明显升高(Plt;0.05)。在RSV病毒感染的第3天和第7天，实验组小鼠血清中IL-23p19的浓度较对照组明显升高(Plt;0.05)；在RSV病毒感染后第1、3、7天，实验组小鼠脾淋巴细胞Th17亚群比例显著高于对照组(Plt;0.05)，且RSV病毒感染后第7天明显高于第1、3天(Plt;0.05)；在RSV感染后第3天小鼠肺组织出现典型间质性肺炎表现，第7天炎性细胞明显减少。实验组第3、7天小鼠肺组织病理改变评分高于对照组(Plt;0.05)。结论在RSV感染小鼠导致的肺部炎症反应过程中，脾淋巴细胞Th17细胞亚群水平升高并且外周血血清中IL-17A的表达增加，推测Th17细胞可能参与宿主的抗病毒免疫过程。

呼吸道合胞病毒；辅助性T淋巴细胞；白细胞介素-17A

呼吸道感染是临床常见疾病，呼吸道合胞病毒(RSV)是众多病原体中导致呼吸道急性炎症并具有较高致病率和致死率的病毒之一〔1〕。RSV是具有包膜、非节段性、单股负链的RNA病毒，属于副黏病毒科、肺病毒属，只有一个血清型，A和B两个亚型〔2〕。引起全球婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体是RSV，感染此种病毒后能够引起婴幼儿反复喘息、持续性的气道功能紊乱、缺氧等症状，更能诱发严重的肺炎毛细支气管炎〔3〕。辅助性T淋巴细胞(Th)17作为CD4+Th细胞亚群，主要分泌白细胞介素(IL)-17A，此外还分泌IL-6、IL-23、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等细胞因子，这些细胞因子都是强效的炎性细胞趋化因子，能募集炎性细胞到达炎症部位〔4〕。本研究旨在探讨RSV感染后Th17细胞在宿主免疫反应过程中的变化情况及其作用。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 0.25%胰酶细胞消化液(北京达科为生物工程有限公司，中国)；酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(BD公司，美国)；小鼠脾淋巴细胞分离试剂盒(天津灏洋有限公司，中国)；胎牛血清、鸡血清(杭州四季青生物科技有限公司，中国)；淋巴细胞刺激物PMA和lonomycin，台盼兰细胞染色液，淋巴细胞高尔基体阻断剂Brefedin A(BFA)(Sigma公司，美国)；改良型RPMI-1640培养基(HyClone公司，美国)；PerCP/Cy5标记抗小鼠CD3单克隆抗体及同型对照抗体、PE标记抗小鼠IL-17A单克隆抗体及同型对照抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗小鼠CD4单克隆抗体以及同型对照抗体(BD公司，美国)；流式细胞仪(BD FACSCalibur，美国)。

1.2细胞和病毒 在37℃，5%CO2细胞培养箱中利用包含10%胎牛血清和100 U/ml青链霉素的改良型RPMI-1640培养基培养Hep-2细胞(包头医学院遗传教研室提供)，然后进行细胞传代，待细胞状态良好时滴入RSV A亚型Long株(包头医学院病原教研室馈赠)病毒原液，然后在DMEM维持液(含2.5%灭活鸡血清)中培养，经过3次细胞传代，待Hep-2细胞病变达 80%时收获病毒。具体步骤：首先收集Hep-2细胞，然后在37℃水浴和-80℃冰箱温度之间反复冻融3次，4 000 r/min离心10 min后，收集上清液，运用96孔板组织细胞培养半数感染量(TCID50)测定并计算病毒滴度为107.5/ml，分装后置于-80℃冰箱保存备用。

1.3建模 5周龄BALB/c小鼠(购自第四军医大学实验动物中心，合格证号：SCXK(军)2007-007)30只。随机分为对照组和实验组。所有小鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)进行完全麻醉后，对照组(n=15)小鼠鼻腔缓慢滴入0.1 ml的2.5%灭活鸡血清的DMEM维持液。实验组(n=15)小鼠鼻腔缓慢滴入0.1 ml病毒液(TCID50为107.5/ml)。把种病毒的当天，定为第0天，分别在1、3、7 d眼球取血并处死小鼠取脾脏和肺脏。

1.4小鼠外周血IL-17A、IL-23p19细胞因子的表达 将小鼠外周血在20℃下静置2 h，10 000 r/min离心10 min取血清。根据ELISA试剂盒说明书，首先利用试剂盒提供的标准品制作标准曲线，然后经过加样、温育、洗涤后用底物显色，终止显色等步骤后，利用酶标仪(赛默飞，美国)在450 nm波长下测定吸光度(OD)值，计算样品浓度。

1.5小鼠脾淋巴细胞的分离 用无菌眼科剪将脾脏剪成碎块后置细胞筛中，用注射器活塞头研磨组织碎块，用试剂盒中附带的组织稀释液5 ml冲洗细胞筛，滤液转移至新的15 ml离心管中，在室温300 r/min离心5 min后弃上清。取含有1%胎牛血清的RPMI1640培养液3 ml重悬细胞，重悬的细胞悬液收集后小心转移至分装有脾淋巴细胞分离液的15 ml离心管中，25℃，300 r/min，离心20 min。小心吸取分离出来的白色淋巴细胞层，磷酸酸缓冲液(PBS)清洗，做细胞计数。淋巴细胞转移至透气细胞培养瓶中，按每3 ml含106个细胞浓度补加含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，添加丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)，添加Ionomycin和BFA至1 μmol/L，再继续放入细胞培养箱中刺激培养6 h。离心后加入PerCP/Cy5标记抗小鼠CD3单克隆抗体及同型对照抗体、PE标记抗小鼠IL-17A单克隆抗体及同型对照抗体、FITC标记抗小鼠CD4单克隆抗体及同型对照抗体。洗涤后加200 μl的染色缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测，采用FLOWJO 7.6 进行分析。

1.6小鼠肺组织病理检查 脱颈处死小鼠，将剖取的无菌左肺放入装有10%甲醛溶液的玻璃瓶内，在密封真空后肺组织完全沉于瓶底，然后固定充分24 h，最后进行石蜡包埋、切片及苏木素-伊红(HE)染色，最终通过光学显微镜观察小鼠肺组织病理学改变。在200倍光学显微镜下由病理专业人员阅片，根据评分标准〔5〕：肺泡壁充血、炎性细胞浸润、水肿各计1分；腔内渗出、肺内支气管上皮变性各计1分；肺气肿、肺泡腔渗出计1分。累加所有分数，即为病理得分 。

1.7统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1外周血中细胞因子IL-23p19、IL-17A的表达 实验组小鼠在RSV感染后1、3、7 d，血清IL-17A浓度分别为(36.31±0.89)pg/ml、(126.31±2.14)pg/ml、(100.10±1.14)pg/ml，分别高于对照组的(24.87±0.91)pg/ml、(26.39±0.88)pg/ml、(25.01±1.02)pg/ml(Plt;0.05)，实验组感染后第3天显著高于第1天，而感染后第7天低于第3天(均Plt;0.05)。在RSV感染后第1、3、7天，实验组血清IL-23p19浓度分别为(38.54±0.94)pg/ml、(80.31±0.98)pg/ml、(60.61±0.34)pg/ml，分别高于对照组的(20.21±0.72)pg/ml、(19.41±0.43)pg/ml、(20.66±0.81)pg/ml，实验组感染后第3、7天较第1天均显著升高(Plt;0.05)。

2.2小鼠脾淋巴细胞Th17细胞亚群的变化 在RSV感染后第1、3、7天，实验组小鼠脾淋巴细胞Th17亚群比例分别为(0.37±0.04)%、(0.46±0.08)%和(0.98±0.03)%，显著高于对照组的(0.22±0.04)%、(0.26±0.03)%、(0.21±0.07)%(均Plt;0.05)，且实验组RSV感染后第7天明显高于第1天和第3天(Plt;0.05)。

2.3小鼠肺组织病理学变化 对照组小鼠肺泡壁光滑，肺间质无炎性细胞浸润，肺组织未见异常变化。实验组小鼠在病毒感染后第1天肺间质已有炎性细胞浸润，第3天小鼠肺组织出现典型间质性肺炎表现，毛细血管扩张充血，肺泡腔明显狭窄，炎性细胞浸润，第7天可见肺间质的炎性细胞浸润较第3天明显减轻。第1、3、7天实验组小鼠肺组织病理改变评分分别为(3.30±0.76)分、(5.60±0.65)分、(4.00±0.71)分，与对照组的(0.80±0.35)分相比，第3、7天明显高于对照组(Plt;0.05)。见图1。

图1 各组肺组织在RSV 感染后1、3、7 d的病理变化(HE，×400)

3 讨 论

RSV感染引起的RSV肺炎是导致婴幼儿下呼吸道感染的常见原因，患病时年龄越小，RSV病毒的表达量越高，其病情会越严重，从而导致住院时间及临床反应持续的时间越长〔6〕。婴儿时期有严重RSV肺炎病史的儿童，以后发展成哮喘等过敏性疾病的概率就会增加，而且可能影响儿童免疫系统的发育。RSV感染可引起包括Th1和Th2细胞分泌的细胞因子及T细胞亚群比例失衡的现象〔7〕。Th1类免疫反应是最及时最有效的抗感染机制，Th1相关途径中任何一个环节受制约都会造成感染加重和持续，例如不能产生高浓度干扰素(IFN)-γ、IL-12、肿瘤坏死因子(TNF)或活性一氧化氮(NO)及抗感染因子IL-10含量降低，容易形成肺部肉芽肿〔8〕。在以往的研究中〔9〕，Th1、Th2平衡能够解释免疫反应中的炎症反应机制，Th1类反应一般是对病原导致的急性期炎症的应答，而Th2则是与病原清除和感染恢复有关。IL-4是Th2细胞分化的重要细胞因子，IFN-γ和IL-4既分别是Th1和Th2类细胞的自分泌细胞生长因子，也是有互相抑制作用的细胞因子〔10〕。

Th17作为一种辅助性T细胞，由在IL-6和IL-23的刺激下TH0细胞分化而产生，主要分泌促炎症因子包括IL-17、IL-22等，在机体防御反应和自身免疫性疾病中具有重要的临床意义〔11〕。IL-17是一种前炎性细胞因子，能够招募中性粒细胞和促进多种细胞释放炎性因子的功能，可以增加气道的高反应性，刺激气道黏液腺大量分泌黏液，在哮喘气道重塑的过程中起到重要的作用。 IL-23虽然不是启动初始CD4+T细胞分化Th17的关键因子，但当Th17 细胞分化处于后期时能起到稳定分化的作用，研究显示小鼠缺乏IL-23几乎不能分化出 Th17淋巴细胞〔12〕。本实验结果说明IL-17参与了机体的抗病毒免疫反应。本研究还发现在RSV感染后第3天血清IL-23p19水平含量到达峰值，但是第7天有所下降，这可能是因为IL-23p19的刺激分化Th17细胞。在RSV感染后的第3天和第7天，小鼠脾脏淋巴细胞中Th17细胞水平显著升高，于第7天处于峰值，然而这时肺组织中的炎症反应却有所降低，这可能是病毒感染后机体受到刺激启动免疫反应，使得 Th17细胞转移至脾脏中，参与抗病毒免疫，并在病毒被清理后保持一定的免疫反应。胡婵婵等〔13〕研究显示其模型组在感染RSV的第3天，Th17的数量明显升高，同本研究结果一致，用RSV(Long株)滴鼻48 h后检测肺部病理得分同对照组相比具有统计学意义，而本研究结果是在第3和7天有统计学意义，可能是由于研究方法不同或没有检测48 h的结果引起的。总之，小鼠在RSV感染后，脾淋巴细胞中Th17细胞的比例升高且外周血血清中 IL-17A的表达增高，本次研究表明Th17淋巴细胞亚群及其分泌的IL-17A和IL-23p19炎性细胞因子参与了宿主抗病毒的免疫反应过程。

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2张小瑜,赵 燕,王导新,等.罗格列酮通过减少Th17细胞极化减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤〔J〕.基础医学与临床,2016;36(7):902-6.

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4刘瑞清,张国成,黄可飞,等.重组人干扰素α1b对呼吸道合胞病毒感染小鼠外周血T淋巴细胞亚群及肺组织病理学的影响〔J〕.现代生物医学进展,2013;13(9):1639-44.

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7赵茜叶,周旭华,于艳艳,等.呼吸道合胞病毒毛细支气管炎患儿Th17细胞亚群的变化〔J〕.临床儿科杂志,2014;32(2):193.

8Kim TH,Lee HK.Innate immune recognition of respiratory syncytial virus infection〔J〕.BMB Rep,2014;47(4):184-91.

9Yoshizaki A,Yanaba K,Iwata Y,etal.Cell adhesion molecules regulate fibrotic process via Th1/Th2/Th17 cell balance in a bleomycin-induced scleroderma model〔J〕.J Immunol,2010;185(4):2502-15.

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12Feng J,Hu Y,Song Z,etal.Interleukin-23 facilitates Th1 and Th2 cell differentiation in vitro following respiratory syncytial virus infection〔J〕.J Med Virol,2015;87(4):708-15.

13胡婵婵,袁 斌,周立华,等.清肺口服液对RSV感染小鼠Treg/Th17及IL-2和IL-17水平的影响〔J〕.中国中医急症,2016;6(25):941-4.

〔2017-03-20修回〕

(编辑 袁左鸣)

R56

A

1005-9202(2017)21-5271-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.023

1 包头市中心医院儿科

李 燕(1983-)，女，硕士，主治医师，主要从事微生物方面的研究。