桑枝内生菌代谢产物抑制α-葡萄糖苷酶和抗氧化活性研究

贾亚楠，逯海朋，喻艳，刘欣瑾，陈伟，曾令树，潘敏慧，徐立*

1(西南大学 生物技术学院，重庆，400715) 2(蚕业科学技术研究院，重庆，400700)

桑枝内生菌代谢产物抑制α-葡萄糖苷酶和抗氧化活性研究

贾亚楠1，逯海朋1，喻艳1，刘欣瑾1，陈伟1，曾令树2，潘敏慧1，徐立1*

1(西南大学 生物技术学院，重庆，400715) 2(蚕业科学技术研究院，重庆，400700)

从严格表面消毒的桑枝中分离、纯化内生菌，根据菌株的形态与培养特征、生理生化特性、16S r DNA序列分析对其进行菌种鉴定，并检测其发酵液不同萃取相抑制α-葡萄糖苷酶活性和抗氧化活性。通过初步活性筛选发现，有3株内生假单胞菌发酵液抑制α-葡萄糖苷酶活性和抗氧化活性较好，进一步对其发酵液的乙酸乙酯、正丁醇萃取部分及其剩余水相进行活性检测。结果显示，菌株4c发酵液乙酸乙酯相(ethyl acetate extract，EAE)抑制α-葡萄糖苷酶活性和清除ABTS+·最好，IC50分别为1.749 mg/mL和1.376 mg/mL；菌株2s发酵液EAE清除DPPH·活性最好，IC50为0.048 mg/mL，总还原力最强，抗坏血酸当量(ascorbic acid equivalent，AEE)为191.627 mg AAE/g dw。

桑枝；内生菌；假单胞菌；α-葡萄糖苷酶；抗氧化；菌种鉴定

桑树是一种在中国乃至亚洲广泛种植的经济作物，具有很高的药用价值。桑枝含有多种化学成分，主要有黄酮类化合物、生物碱、多糖和香豆精类化合物，以及氨基酸、有机酸、挥发油及多种维生素等。其中的生物碱[1]、多糖类和黄酮类具有很好的降血糖活性[1-4]和抗氧化活性[5]。

内生菌是生长在健康植物组织内部的微生物，几乎存在于所有目前已研究过的植物中。美国学者STIERLE[6]等人从短叶紫杉(Taxusbrevifolia)的树皮中分离出1株内生真菌(Taxomyces andreanae)，在其培养液中发现了紫杉醇(taxol)和其他紫杉烷类化合物。这为人类突破植物资源周期长，不可再生等限制，利用植物内生菌工业化发酵生产重要植物源药物提供了新思路。在过去的几十年里，植物内生菌在生物工程与技术领域，均展现出了巨大的自然资源优势[7]。

α-葡萄糖苷酶(α-glycosidase)是一类能够从含有α-糖苷键底物的非还原端催化水解葡萄糖基酶的总称，参与人体多种能源物质的合成与消化代谢过程[8]。因此，α-糖苷酶抑制剂的开发对糖尿病患者控制餐后血糖水平具有重要的意义。活性氧(ROS)是细胞代谢过程中所产生的自由基，会导致蛋白质、脂肪、DNA等生物大分子的氧化损伤，人如果长期处于氧化损害状态，会导致诸如心血管疾病、慢性炎症、动脉粥样硬化等慢性疾病[9]。因此，抗氧化剂的研究对治疗心血管疾病、慢性炎症等具有重要的意义。

桑树内生细菌主要包括芽孢杆菌属(Bacillussp.)、假单胞菌属(Pseudomouassp.)、欧文氏菌属(Erwiuiasp.)、短小杆菌属(Curtobacteriumsp.)以及洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)。武婷婷[10]等人从桑树中分离出1株具有抑制α-糖苷酶活性的内生萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)；路国兵[11]等人曾报道过桑树内生假单胞菌属(Pseudomonassp.)和欧文氏菌属(Erwiniasp.)发酵液的抑菌活性；张飞官[12]等人从桑树中分离出1株对桑疫病病原菌具有拮抗作用的成团泛菌(Pagglomerans)。桑树内生菌作为一种天然资源库，具有重要的研究意义。

为了探讨桑枝内生细菌代谢产物作为α-糖苷酶抑制剂和抗氧化剂的潜能，本实验从新一之濑桑枝中分离出了29株内生菌，筛选出3株α-糖苷酶抑制活性和抗氧化活性较好的菌株，并对其发酵液的乙酸乙酯和正丁醇萃取部分及剩余水相抑制的α-糖苷酶抑制活性和抗氧化活性进行评估，为桑枝内生细菌的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

桑枝(新一之濑)由重庆市蚕业科学技术研究院提供。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG)、阿卡波糖(Acarbose)，上海源叶生物公司；乙酸乙酯、正丁醇、乙醇：工业纯，重庆川东化工有限公司；奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox)、抗坏血酸(ascorbic acid)、K3Fe(CN)6：分析纯，成都科龙化工试剂厂； 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)：分析纯，南京都莱生物技术有限公司。

细菌DNA提取试剂盒，PCR体系，生工生物工程(上海)有限公司；16S rDNA基因扩增所用PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；细菌生化鉴定管，青岛海博生物技术有限公司。

1.2仪器与设备

R-210型旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；纯水仪，法国Millipore公司；VS-1300L-U超净工作台，苏净安泰空气技术有限公司；B-491恒温水浴锅，国华电器有限公司； QL-901涡旋仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；BIORAD酶标仪，美国Bio-Rad公司；紫外分光光度计，德国Thermo公司；PCR仪，美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1 内生菌分离与鉴定

1.3.1.1 内生菌的分离

将供试桑树材料用自来水洗净、晾干备用。参考张飞官[12]等的方法，将桑枝剪成5 cm茎段，在75%乙醇中灭菌1 min，取出，在酒精灯处燃尽酒精。用解剖刀取桑枝表皮、韧皮部组织和木质部组织，并将其切面接种在PDA培养基中。以环境对照和桑枝印迹为对照，确保分离得到的菌株为桑枝内生菌。28 ℃培养24 h，观察，待桑枝组织周围出现菌落后，挑取菌落到新的培养基上。平板划线法反复纯化，直至获得单菌落。

1.3.1.2 细菌16S rDNA序列测定及其系统发育树的构建

目的菌株培养12 h后，用细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA，以通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR扩增细菌16S rDNA序列。

PCR反应条件：预变性：94 ℃，5 min；变性：94 ℃，1 min；退火：50 ℃，1 min；延伸：72 ℃，2 min，25个循环；再延伸：72 ℃，10 min；10 ℃保温。

PCR产物由生工生物工程(上海)有限公司测序，所得16S rDNA基因序列在NCBI数据库里进行比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下载GenBank中同源性较高序列，利用MEGA 4.0软件，构建系统发育树。

1.3.1.3 生理生化鉴定

根据《常见细菌系统鉴定手册》[13]对其进行生理生化鉴定，包括：菌株培养特征观察、菌体及菌落形态观察；革兰氏染色、氧化酶试验、接触酶试验、明胶液化试验、水解淀粉试验、脂酶(Tween80)试验、精氨酸双水解酶试验、甲基红(MR)试验、V-P和脓青素(绿脓菌素)产生的试验。

1.3.2 活性物质提取

挑取单菌落置于200 mL的PDA液体培养基中，28 ℃，转速200 r/min，培养4 d。获得的菌液，9 000 r/min，离心20 min，弃菌体，得上清。加3倍体积乙醇沉淀蛋白质和多糖；功率60%，超声波助提40 min。12 000 r/min常温离心10 min，弃沉淀，得上清液，旋转蒸发浓缩到1/8体积。分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取，得不同萃取相的萃取物。

1.3.3 抑制α-葡萄糖苷酶活性检测

参考CHAO和JI[1, 14]等的方法。取不同稀释浓度的萃取物溶液、α-葡萄糖苷酶溶液(0.5 U/mL)及磷酸钾缓冲液(67 mmol/L，pH 6.8) 各50 μL混合，充分振荡，37 ℃预保温15 min，加入50 μLpNPG溶液(6 mmol/L)，再于37 ℃酶解15 min，加200 μL Na2CO3溶液(0.2 mol/L)终止反应，每个处理分别做3个重复。各取200 μL反应液于96孔板孔中，用酶标仪在415 nm波长下测定吸光值。实验以阿卡波糖(Acarbose)为阳性对照，按公式(1)计算抑制率，并用SPSS软件计算相应IC50值：

抑制率/%=[ 1-(As-Ab) /Ac]×100

(1)

式中：Ac为对照组吸光度；As为样品组吸光度；Ab为空白组吸光度。

1.3.4 清除DPPH自由基活性检测

参考GARRY和TAI[15-16]等的方法。取不同稀释浓度的萃取物溶液和DPPH乙醇溶液(2×10-4mol/L) 各2 mL混合，摇匀，在室温下，避光反应30 min。每个处理分别做3个重复。移取200 μL反应液于96孔板孔中，用酶标仪在490 nm下测定吸光值。实验以抗坏血酸(ascorbic acid)为阳性对照，按公式(2)计算抑制率，并用SPSS软件计算相应IC50值：

抑制率/%=[ 1-(As-Ab)/Ac]× 100

(2)

式中：Ac为对照组吸光度；As为样品组吸光度；Ab为空白组吸光度。

1.3.5 清除ABTS+·活性检测

参考MAHAYOTHEE[17]等的方法。 ABTS溶液(7 mmol/L)和过硫酸钾溶液(2.45 mmol/L)以2∶1的体积比混合，在室温避光的条件下，静置过夜，形成ABTS+·储备液。加适量磷酸盐缓冲溶液(0.5 mmol/L，pH 7.4)将ABTS+·储备液稀释成工作液，要求其在734 nm波长下的吸光度为0.7±0.02。

取100 mmol/L不同稀释浓度的萃取物溶液，加入3 mL ABTS+·工作液，准确振荡30 s，反应6 min，测定734 nm处的吸光值。实验以奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox)为阳性对照，按公式(3)计算抑制率，并用SPSS软件计算相应IC50值：

抑制率/%=[ 1-(As-Ab)/Ac]×100

(3)

式中：Ac为对照组吸光度；As为样品组吸光度；Ab为空白组吸光度。

1.3.6 总还原力的测定

参考YEN和KOWALSKI[18-19]等的方法。取各萃取物1 000 μg，加入1 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L, pH 6.6) 和1 mL K3Fe(CN)6溶液(10 mg/mL)，在50 ℃下保温20 min，冰浴终止。向上述混合液中加入1 mL三氯乙酸溶液(100 mg/mL)，再加1 mL FeCl3溶液(1mg/mL)，混合，充分振荡，在700 nm下测定吸光值(抗坏血酸的质量浓度设置为：1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、 7.81、0 μg/mL。 按上述步骤操作。)。以抗坏血酸的标准品做标准曲线，样品的总还原力以抗坏血酸的含量表示，记为1 g干重样品含量抗坏血酸的质量，即抗坏血酸当量(AEE)，单位为mg AAE/g dw。

1.3.7 统计与分析

每个实验处理平行3次，试验数据采用SPSS 17.0软件、Image Lab软件分析，作图使用Origin 8.0软件。

2 结果与讨论

2.1内生菌的分离纯化

采用平板稀释法，从桑枝(新一之濑)中分离获得到29株内生细菌，通过初步活性筛选，有3株菌(2s、4b和4c)具有较好的抑制α-葡萄糖苷酶活性和抗氧化活性。

2.2内生菌的鉴定结果

2.2.1 形态及培养特征

菌种2s的菌落圆扁平形，淡绿色，边缘整齐，培养基呈现淡绿色；菌种4b的菌落圆形，边缘半透明，中间白色突起，外边缘不规则，有晕圈；菌种4c的菌落圆形，边缘半透明，中间白色突起，外边缘不规则，有晕圈，如图1。

图1 菌株形态观察图Fig.1 Morphological examination of strains

2.2.2 16S r DNA 系统发育分析

以菌株2s、4b和4c基因组DNA为模板，扩增其16S r DNA序列并测序。将其序列相关信息提交到Gen Bank，获得相应登录号KY458640、KY458642以及KY458641，结果详见表1。

表1 菌株的16S rDNA片段在NCBI上的对比结果

利用BLAST程序与Gen Bank中已登录的基因序列进行比对，选取与其同源性较高且已定名的菌株的相关序列信息，进行系统发育分析，用MEGA4.0中的N-J法构建系统进化树(图2)。由图2可知，菌株4b和4c亲缘关系相对较近，与菌株2s亲缘关系相对较远。

2.2.3 生理生化鉴定

基于《常见细菌系统鉴定手册》[13]对菌株2s、4b和4c进行生理生化鉴定。检测结果表明，菌株2s、4b和4c均能够水解明胶，产生精氨酸双水解酶；均不能水解淀粉；均不能产生脂酶、氧化酶、接触酶和脓青素；甲基红(MR)和V-P均显阴性；均不具有反硝化能力。结果详见表2。

图2 依据16S r DNA基因序列构建菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree constructed according to the 16S rDNA gene sequence of strains

表2 菌株2s、4b和4c的生理生化试验结果

注：+：阳性(生长成反应)；-：阴性(不生长或不反应)。

根据桑枝内生菌株2s、4b和4c的菌体形态、培养特征及生理生化特征测定结果，并结合基于16S r DNA 的系统发育分析，鉴定结果为：菌株2s为绿黄假单胞菌(Pseudomonasviridiflava)，4b和4c为丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)。

2.3抑制α-葡萄糖苷酶活性

为进一步研究菌株2s、4b和4c发酵液抑制α-葡萄糖苷酶活性物质的分段，对其发酵液进行了不同极性的萃取，结果如图3所示。菌株2s、4b和4c发酵液乙酸乙酯相(ethyl acetate extract，EAE)、正丁醇相(n-Butyl alcohol extract，NBAE)以及剩余水相(water extract，WAE)对α-葡萄糖苷酶具有明显的体外抑制作用，并呈现量效关系。

图3 菌株2s、4b和4c发酵液不同萃取相α-葡萄糖苷酶抑制活性随浓度的变化Fig.3 Strains fermented liquid phase in different extraction to inhibit α-glucosidase activity along with the change of the concentration of free radical activity

通过SPSS软件分析其不同菌株，不同萃取相抑制α-葡萄糖苷酶IC50，结果如图4所示。3株内生假单胞菌发酵液不同萃取相中，抑制α-葡萄糖苷酶活性为EAEgt;NBAEgt;WAE(**plt;0.01)。

对于EAE部分抑制α-葡萄糖苷酶IC50，菌株4c(1.749 mg/mL)lt; 2s(3.058 mg/mL)lt;4b(6.576 mg/mL)，说明菌株4c发酵液EAE部分抑制α-葡萄糖苷酶活性显著高于菌株2s、4b(plt;0.05)；对于NBAE部分，菌株2s(4.121 mg/mL) lt;4c(9.912 mg/mL)lt;4b(14.088 mg/mL)，菌株2s发酵液NBAE部分抑制α-葡萄糖苷酶活性显著高于菌株4b、4c(plt;0.05)；对于WAE部分，菌株2s(29.857 mg/mL)lt;4c(35.962 mg/mL)lt;4b(43.117 mg/mL) ，菌株2s发酵液WAE部分抑制α-葡萄糖苷酶活性显著高于菌株4b、4c (plt;0.05)。

图4 菌株发酵液不同萃取相抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值Fig.4 The IC50 of strains fermented liquid phase in different extraction to inhibit α-glucosidase

由此可知，桑枝内生假单胞菌发酵液抑制α-葡萄糖苷酶活性的活性物质主要分布在乙酸乙酯部分，是一类小极性物质。3株假单胞菌发酵液不同萃取相比较，菌株4c发酵液乙酸乙酯部分活性最好，但仍显著差于阳性对照阿卡波糖(IC50：1.749 mg/mLgt;0.011 μg/mL，plt;0.05)。

目前关于这3株假单胞菌发酵液抑制α-葡萄糖苷酶抑制活性物质基础尚未明确，有必要进一步在生物活性的指导下开展活性物质分离与鉴定的研究，从而发现高活性α-葡萄糖苷酶抑制剂的先导化合物。

2.4发酵液抗氧化活性分析

自由基能够对生物细胞分子产生明显的氧化损伤，所以清除自由基对生物分子抗氧化防御体系非常重要。分别检测了3株内生假单胞菌发酵液不同萃取相对DPPH·、ABTS+·的清除能力，以及总还原力的检测。

2.4.1 清除DPPH·活性

如图5所示，3株内生假单胞菌不同萃取相对DPPH·均具有很好的清除效果，并呈现量效关系。

图5 菌株2s、4b和4c发酵液不同萃取相的清除DPPH·活性随浓度的变化Fig.5 Strains fermented liquid phase in different extraction to remove DPPH free radical activity along with the change of the concentration of free radical activity

由图6可知，3株内生假单胞菌发酵液不同萃取相中，清除DPPH·自由基能力为EAEgt; NBAEgt; WAE(**plt;0.01)。

对于EAE部分，菌株2s(0.048 mg/mL)lt;4c(0.050 mg/mL)lt;4b(0.149 mg/mL)，菌株2s和4c发酵液的EAE清除DPPH·能力显著高于菌株4b(plt;0.05)，菌株2s和4c发酵液的EAE清除DPPH·能力差异不显著(pgt;0.05)；对于NBAE部分，菌株2s(0.457 mg/mL)lt;4c(0.589 mg/mL)lt;4b(1.032 mg/mL)，菌株4c发酵液的NBAE清除DPPH·自由基能力显著性高于菌株4b、2s(plt;0.05)；对于WAE部分，菌株4c(1.012 mg/mL)lt;2s(2.399 mg/mL)lt;4b(3.012 mg/mL)，菌株4c发酵液的WAE清除DPPH·能力显著性高于菌株2s、4b(plt;0.05)。

由此可知，桑枝内生菌发酵液清除DPPH·的活性物质主要在乙酸乙酯部分。3株内生菌发酵液活性相比较，菌株2s和4c发酵液乙酸乙酯部分活性最好，与阳性对照抗坏血酸清除DPPH·的能力无显著差异(2s: 0.048 mg/mL；4c：0.050 mg/mL；抗坏血酸：0.014 mg/mL，pgt;0.05)。

图6 菌株发酵液不同萃取相的清除DPPH·活性的IC50值Fig.6 The IC50 of strains fermented liquid phase in different extraction to remove DPPH free radical activity

2.4.2 清除ABTS+·能力

如图7所示，3株内生假单胞菌不同萃取相对ABTS+·均具有很好的清除效果，并呈现量效关系。

图7 菌株2s、4b和4c发酵液不同萃取相清除ABTS+·活性比较Fig.7 Strains fermented liquid phase in different extraction to remove ABTS free radical activity along with the change of the concentration of free radical activity

由图8可知，菌株2s、4b和4c菌液不同萃取相中，清除ABTS+·能力为EAEgt;NBAEgt; WAE(**plt;0.01)。

对于EAE部分清除ABTS+·能力的IC50，菌株4c(0.226 mg/mL)lt;2s(0.236 mg/mL)lt;4b(0.393 mg/mL)，菌株4c和2s没有显著性差异(pgt;0.05)，但均显著优于菌株4b清除ABTS+·能力(plt;0.05)；对于NBAE部分清除ABTS+·能力的IC50，菌株4c(1.376 mg/mL) lt;2s(1.384 mg/mL)lt;4b(3.317 mg/mL)，菌株4c和2s没有显著性差异(pgt;0.05)，但都显著优于菌株4b清除ABTS+·能力(plt;0.05)；对于WAE部分清除ABTS+·能力的IC50，菌株4b(4.658 mg/mL) lt;2s(5.102 mg/mL)lt;4c(9.068 mg/mL)，菌株4b清除ABTS+·能力显著优于菌株2s、4c(plt;0.05)。

桑枝内生菌发酵液清除ABTS+·的活性物质主要分布也在乙酸乙酯部分。3株内生菌发酵液清除ABTS+·活性相比较，菌株4c发酵液乙酸乙酯部分活性最好，但显著差于阳性对照Trolox清除ABTS+·活性(IC50：0.079 mg/mL)。

图8 菌株发酵液不同萃取相清除ABTS+自由基活性的IC50值Fig.8 The IC50 of strains fermented liquid phase in different extraction to remove ABTS+free radical activity

2.4.3 总还原力的检测

总还原力是评价样品抗氧化性能的常用方法，通常物质的还原能力与抗氧化能力呈正相关[20]。在本次实验中，抗坏血酸标准曲线如图9-A所示，R2=0.999，线性关系良好。根据回归方程y=0.031 1x+0.043 4，计算内生假单胞菌发酵液不同萃取相的抗坏血酸当量，结果如图9-B所示。

在3株内生假单胞菌发酵液不同萃取相中，EAE的总还原力显著高于NBAE，NBAE的总还原力显著高于WAE。

图9 菌株2s,4b和4C发酸的不同萃取相抗坏血酸当量比较Fig.9 Strains 2s,4b anel 4C fermentation broth in defferent extraction phase of ascorbic acid quivalent

发酵液EAE的抗坏血酸当量：菌株2s(191.627 mg AAE/g dw)gt;4c(150.566 mg AAE/g dw)gt;4b(145.389 mg AAE/g dw) (**plt;0.01)。由此可知，菌株2s发酵液EAE的总还原力显著高于菌株4b、4c(plt;0.05)；发酵液NBAE的抗坏血酸当量：菌株4c(44.360 mg AAE/g dw)gt;2s(36.225 mg AAE/g dw)gt;4b(21.096 mg AAE/g dw)。由此可知，菌株4c发酵液NBAE的总还原力显著高于菌株2s、4b(plt;0.05)；发酵液WAE的抗坏血酸当量：菌株2s(17.069 mg AAE/g dw)gt;4b(15.035 mg AAE/g dw) gt;4c(13.661 mg AAE/g dw)，菌株2s发酵液WAE的总还原力显著高于菌株4b、4c(plt;0.05)。

3株内生假单胞菌不同萃取相清除DPPH·活性、清除ABTS+·活性以及总还原力的检测结果均表明，内生菌发酵液萃取物具有很好的抗氧化活性。且其清除自由基的活性成分多属于中、小极性物质。通过TLC和HPLC检测，发现具有多个活性物质，且这些活性物质极性极为相似，难以分离纯化得到单体。因此，我们推测内生菌发酵液抗氧化活性物质可能为结构相似的一类化合物。

3 结论

本研究从新一之濑桑枝中分离并鉴定出了3株内生假单胞菌，其代谢产物具有一定的抑制α-葡萄糖苷酶活性和抗氧化活性，经检测，其活性物质主要分布在乙酸乙酯部分，正丁醇部分次之，水相相对较少。其中，菌株4c发酵液EAE部分抑制α-葡糖糖苷酶活性和清除ABTS+·活性最好，IC50分别为：1.749 mg/mL、1.376 mg/mL。菌株2s发酵液EAE清除DPPH·自由活性最好，IC50为0.048 mg/mL，总还原力最强，AEE当量为191.627 mg AAE/g dw。本研究为利用植物内生菌发酵生产具有降血糖和有抗氧化功能的保健食品提供了理论参考。

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Theinhibitionofα-glucosidaseandantioxidantactivityofendophytemetaboliteisolatedfrommulberry

JIA Ya-nan1, LU Hai-peng1, YU Yan1, LIU Xin-jin1, CHEN Wei1, ZENG Ling-shu2, PAN Min-hui1, XU Li1*

1(College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China) 2(Institute of Sericulture Science and Technology Research, Chongqing 400700, China)

The endophytes were separated and purified from mulberry twigs,and their species were further identified using morphological observation, physiological and biochemical characteristics and molecular biology method. The inhibition of α-glucosidase and the activities of antioxidant in different extractive phases of fermentation broth of the endophytes were examined. The preliminary activities screening showed that three strains of endophytePseudomonasfermentation broth had a good inhibiting activity for α-glucosidase and good antioxidant activities. Two kinds of solvents with different polarity were used, and named as EAE, NBAE and WAE, respectively. The fermentation liquid was extracted and detected. The EAE (ethyl acetate extract) of strain 4c fermentation broth has a good α-glucosidase inhibition and ABTS+· scavenging capacity. IC50was 1.749 mg/mL and 1.376 mg/mL respectively. The EAE of strain 2s fermentation broth had the strongest DPPH· scavenging activity with the IC50of 0.048 mg/mL and the best total reducing power with the ascorbic acid equivalent (AEE) of 191.627 mg AAE/g dw. This research is so vital to offer a reference for the application of mulberry endophytic bacteria in producing function food.

Mulberry Twig; endophytes; Pseudomonas; α-glucosidase; antioxidant; strain identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014921

硕士研究生(徐立副教授为通讯作者，E-mail:mulberry@swu.edu.cn)。

中央高校基本科研业务费(XDJK2016E104，XDJK2017D115)；重庆市科委民生项目(CSCT2017shms—xdny80083);国家蚕桑产业技术体系(CARS-22-ZJ0204)

2017-06-08，改回日期：2017-08-04