基于量子点荧光层析试纸条法快速检测三聚氰胺

赵弟萍, 程克文, 程 琳, 潘道东, 蒋 原,3

(1.合肥工业大学 食品科学与工程学院,安徽 合肥 230009; 2.宁波大学 海洋学院,浙江 宁波 315211; 3.江苏出入境检验检疫局 动植物与食品检测中心,江苏 南京 210001)

基于量子点荧光层析试纸条法快速检测三聚氰胺

赵弟萍1, 程克文2, 程 琳1, 潘道东2, 蒋 原1,3

(1.合肥工业大学 食品科学与工程学院,安徽 合肥 230009; 2.宁波大学 海洋学院,浙江 宁波 315211; 3.江苏出入境检验检疫局 动植物与食品检测中心,江苏 南京 210001)

文章制备了水溶性量子点,建立了一种基于荧光量子点的侧向层析试纸检测新方法,并将该方法用于食品中非法添加剂三聚氰胺的检测。实验结果表明,该荧光试纸条对三聚氰胺检测的肉眼检测限能达到10 ng/mL,检测时间为10 min。该方法省时、快捷、经济,适合于三聚氰胺现场快速检测。

三聚氰胺;量子点;免疫层析试纸条;快速检测

0 引 言

三聚氰胺,化学名1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺,是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,重要的氮杂环有机化工原料[1],工业上主要用作生产三聚氰胺甲醛树脂的原料,此外还可作为阻燃剂、甲醛清洁剂、减水剂等[2]。目前所使用的“凯氏定氮法”[3]存在着无法测出氮来源的缺陷。通过添加三聚氰胺会使以凯氏定氮法测定的蛋白质含量明显提高,因而三聚氰胺常被不法商人用作添加剂添加到乳制品中以提升蛋白质的含量指标[4]。三聚氰胺毒性轻微,但人体长期摄入,尤其是婴幼儿,会造成生殖、泌尿系统的损害,膀胱、肾部结石,并可进一步诱发膀胱癌[5]。三聚氰胺对人体危害性很大,目前三聚氰胺的检测也已成为乳制品检测中的一项必检项目。

量子点是一种半导体纳米材料,通常是由锌、镉、硒、硫等元素化合而成的，三维尺寸均处于纳米范围内的零维半导体材料,它的半径小于或接近于激子玻尔半径。众所周知,当某种物质的尺寸达到纳米尺度时就会显现出一些神奇的特性,量子点也是如此,由于小尺寸效应和量子效应的原因[6],当其受到光或电的刺激时,处于基态的载流子会被激发跳跃到更高的能级,等到这些载流子再回到原激发态时就会发出固定波长的可见光[7],故也称量子点为半导体荧光纳米晶粒。

用于生物分子标记[8]的半导体纳米粒子要连接到生物分子上时必须要求是水溶性的,这可通过在其表面引入极性的官能团达到,实现量子点表面连接亲水性的官能团再与生物材料相连可利用量子点表面的元素(如 Zn、Cd等)与巯基之间强的络合作用力,使量子点与巯基酸络合带上羧基,巯基酸可以是巯基乙酸、巯基丁二酸、二巯基辛酸及巯基丙酸等。文献[9]采用巯基丙酸(MPA)作为稳定剂,直接在水溶液中合成了CdTe半导体纳米粒子,并达到了表面带有羧基的水溶性量子点直接标记生物分子的目的。利用表面修饰后的量子点与生物材料之间的静电吸引作用可实现对生物材料大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的荧光标记,并可用作激光扫描成像、免疫分析的荧光探针,是一种有效荧光示踪工具[10]。量子点激发波长宽,发射波长窄、对称,可用一种波长激发大小不同的同种量子点获得丰富的标记颜色。如ZnS包裹的CdSe量子点,可得到10种不同的标记颜色[11]。本实验在水溶性量子点合成的基础上，将合成的量子点作为标记物进一步应用于荧光免疫层析试制条的研制,目的是借助量子点作为荧光标记材料,提高免疫层析试纸条的检测灵敏度。

1 主要试剂与仪器

1.1 主要试剂

硒粉(纯度99.8%)、巯基丙酸(MPA,纯度99%)、硼氢化钠(NaBH4)、2.5H2O氯化镉(CdCl2·2.5H2O,纯度99.99%)、HAuCl4(纯度99.9%)、均购买于上海百灵威化学技术有限公司。蔗糖、海藻糖、羟基琥珀酰亚胺(NHS)、碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、氯化钠、氢氧化钠、柠檬酸三钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、Tween 20、柠檬酸三钠(分析纯)、磷酸氢二钠(分析纯)、磷酸二氢钠(分析纯)氮气、三聚氰胺标品(化学纯)、牛血清白蛋白(BSA,纯度大于98%)均购于国药集团化学试剂有限公司,分析纯均没有进一步纯化。三聚氰胺人工抗体、羊抗鼠二抗均由江苏省出入境检验检疫局提供。

1.2 主要仪器

AL104分析天平,Mettler Toledo公司;ZF-20D暗箱式紫外分析仪,郑州豫华仪器制造有限公司;EOS600D,单反相机佳能光学设备有限公司;XYZ-3试纸条喷膜仪,Bio-Dot;CM-4000试纸条切条机,Bio-Dot。

2 试验方法

2.1 量子点的制备

称取390 mg Se粉,189 mg NaBH4,4 mL超纯水,在密闭容器中密封反应(盖子表面预留一个小孔以释放反应过程中所产生的气体)。将反应体系置于冰浴中反应24 h,得到前躯体溶液。最终将经过24 h冰浴反应制得的前躯体避光放置于4 ℃冰箱中保存备用。

称量570 mg CdCl2·2.5 H2O于250 mL三颈烧瓶中,加入148 mL超纯水,搅拌使其溶解。随后向反应体系中加入0.5 mL巯基丙酸并用1 mol/L氢氧化钠溶液调节整个反应体系的pH值至7.5。最后反应体系在N2保护下,向其中迅速加入上述已制备好的前躯体上清液2 mL,继续通N210 min后将上述溶液快速转移到高压反应釜中,在180 ℃条件下反应一定的时间。根据控制反应时间和反应温度的长短得到不同粒径即不同荧光发射波长的荧光量子点。

2.2 量子点与抗体偶联复合物的制备

取50 μL水溶性CdSe羧基量子点于1.5 mL棕色离心管中,然后向其中加入5 μL 10mg/mL的EDC和10 μL NHS,随之将整个混合液混合均匀后置于室温下避光活化30 min后,再加入1 mg/mL三聚氰胺抗体6 μL,然后将加入抗体的混合液置于室温下反应2～4 h,待反应充分后将最终得到的反应液置于4 ℃冰箱中储存备用,此反应液作为最终喷至于检测线处的T线喷膜母液。

2.3 试纸条的组装

将量子点与三聚氰胺抗体的偶联复合物以7 μL/pad的量滴加到结合垫上制成荧光结合垫;将三聚氰胺包被原和羊抗鼠二抗以1 mg/mL、 0.4 μL/cm的喷速喷至于包被膜的检测线(T线)和质控线(C线),作为最终的识别区域。

最终组装成的试纸条有80 mm塑料黏性PVC底板,26 mm经处理的样品垫,5 mm经处理过的荧光结合垫,25 mm硝酸纤维材质的包被膜(NC膜)以及29 mm的吸水垫。在组装时,它们依次相互衔接,衔接部分彼此压约2 mm。

2.4 线性检测

实验过程中对三聚氰胺的定性分析是通过用肉眼观测量子点暗场情况下在试纸条的检测线(T线)处的显色情况来确定的。进一步的定量检测则是通过Image J软件对检测线(T线)处的峰面积灰度值进行扫面得来的。具体实验方案如下:

(1) 样品母液的配制。实验过程中用于上样的样品母液是用PBS缓冲液溶解三聚氰胺固体,具体用天平称取0.01 g三聚氰胺固体，然后将其溶解于10 mL pH=7.4 10 mmol/L 磷酸缓冲液。

(2) 样品液的稀释。将事先制备好的三聚氰胺母液用10 mmol/L pH=7.4磷酸盐缓冲溶液稀释成1、2、5、10、50、100 ng/mL不同质量浓度梯度的上样液。

(3) 试纸条上样。分别在组装有荧光结合垫的试纸条上滴加80 μL不同质量浓度梯度的上样液,放置室温避光3 h待包被膜完全干燥后放入紫外暗箱中用肉眼观察在紫外激发下检测线(T线)的出线情况，然后用单反相机拍摄暗场出线结果。

(4) 定量分析。将拍摄的暗场试纸条检测线(T线)处的照片结果用Image J软件进行峰面积灰度值扫描处理,并将最终得到的数据用Origin数据处理软件进行处理分析，从而得到最终目标物的检测限与检测范围。

(5) 标准曲线的建立。用制备好的试纸条检测一系列已知质量浓度的三聚氰胺;用Image J软件扫描上述试纸条得到T、C线的灰度值,根据检测线(T线)灰度值和三聚氰胺质量浓度做出标准曲线。

2.5 特异性检测

实验过程中,为了保证除目标检测液之外的实验条件的一致性,采取同一批组装好的试纸条、结合垫、稀释缓冲液以及上样步骤,分别对含有三聚氰胺、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)及其混合物的目标液进行检测,具体实施步骤如下:

(1) 样品液的稀释。将三聚氰胺、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脱氧腺苷三磷酸(dNTP)分别用0.01 mol/L pH=7.4磷酸盐缓冲溶液进行稀释,其中三聚氰胺稀释到50 ng/mL,赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脱氧腺苷三磷酸(dNTP)稀释到100 mg/mL,得到含有不同检测物的稀释上样液,其中阴性对照(即空白组)采用磷酸缓冲液上样。

(2) 试纸条上样。分别在组装有荧光结合垫的试纸条上滴加80 μL不同质量浓度梯度的上样液,放置室温避光3 h待包被膜完全干燥后放入紫外暗箱中，用肉眼观察在紫外激发下检测线(T线)的出线情况，然后用单反相机拍摄暗场出线结果。

(3) 定量分析。将拍摄的暗场试纸条检测线(T线)处的照片结果用Image J软件进行试纸条检测线(T线)的灰度值,并将最终得到的数据用Origin数据处理软件进行处理分析，根据检测线(T线)灰度值和检测物的种类做出柱状图。

2.6 实际样品检测

针对模拟实际样品检测,本文采取从超市购买的新鲜牛奶,将其经液相色谱确证阴性后,用于实际样品检测,具体实施方案如下:

(1) 取10 mL牛奶加入不同量的三聚氰胺标准样,使牛奶中三聚氰胺添加量达到10、20、50、100 ng/mL,并分别编号为食品样品 2、3、4、5号上样液。

(2) 取新鲜牛奶样品为食品样品1号,作为空白对照。加入标样处理1 h后,在4 ℃、4 000 r/min离心15 min后除去上层脂肪即可用于检测。

(3) 试纸条上样。分别在组装有荧光结合垫的试纸条上滴加80 μL不同质量浓度梯度的事先稀释好的上样液,待上样过后的试纸条置于室温条件下等其完全干燥之后，将其置于暗箱式紫外分析仪中进行观察,然后拍摄暗场出线结果。

(4) 定量分析。将拍摄的暗场试纸条检测线(T线)处的照片结果用Image J软件进行峰面积灰度值扫描处理,并将最终得到的数据用Origin数据处理软件进行处理分析，从而得到最终目标物肉眼检测限。

3 结果分析

3.1 三聚氰胺检测原理

传统的基于胶体金标标记的试纸条根据反应原理可以分为夹心法试纸条和竞争法试纸条。本文在传统的基于胶体金标记的试纸条检测方法的基础上,采用量子点作为荧光标记物研发出基于荧光量子点标记的荧光试纸条法来检测食品中非法添加剂三聚氰胺,具体检测原理如图1所示。

该方法所采用的是竞争法试纸条检测原理。在试纸条的荧光量子点标记的结合垫上固定具有识别功能的三聚氰胺识别抗体与量子点的偶联复合物,在包被膜(NC)膜检测线(T线)处固定有检测目标物对应的包被原即三聚氰胺包被原,在质控线(C线)处固定有识别抗体的二抗。检测线(T线)处的三聚氰胺包被原其实与检测目标物三聚氰胺是同一种物质,其可以竞争与量子点结合上的识别抗体的结合位点。检测时,如果待测溶液中没有目标检测物三聚氰胺,结合垫上与量子点耦联的识别抗体的结合位点就不会被待测液中的目标检测物三聚氰胺所占据,这样与量子点结合的识别抗体就会与检测线(T线)处的包被原所结合,此时检测线(T线)处就能够捕获到量子点，从而在紫外暗箱中就可以观测到荧光从而显线。反之,如果待测溶液中有目标检测物三聚氰胺存在,那么当待测溶液流过量子点标记的结合垫时，结合垫上与量子点耦联的识别抗体就会与目标物检测物结合,这样结合垫上的识别抗体的识别位点就会被待测液中的目标检测物所占据，从而就不能与检测线(T线)处的三聚氰胺包被原结合,检测线(T线)处就不能捕获量子点,因此此时在紫外暗箱中观察时整个试纸条检测线(T线)处无荧光,继而不能显线。对于质控线(C线)而言,无论待测溶液中有无目标检测物,都可以在紫外暗箱中观察到荧光线条,若C线没有成功显线,则说明试纸条检测结果无效。

图1 三聚氰胺检测原理图

3.2 量子点的表征

量子点之所以能发出不同颜色的荧光主要是由于量子点的量子效应。众所周知,当某种物质的尺寸达到纳米尺度时就会显现出一些神奇的特性,量子点也是如此。由于量子点粒径很小,它的电子和空穴就会被量子限域,连续能带变成具有分子特性的分立能级。当受到光或电的刺激时,处于低能级的载流子会被激发跳跃至更高的能级,等到这些载流子再回到低能级激发态时就会发出固定波长的可见光,即发射荧光。量子点的粒径大小控制着它的荧光性能,不同大小的量子点具有不同的荧光光谱图及发射不同颜色的荧光。本实验制备的不同发射波长的量子点的荧光光谱图如图2所示。

从图2b可以看出,本文所制备的5种量子点对应的波谱峰分别为500、545、570、605、625 nm,分别对应的颜色为绿色、黄绿色、黄色、橙色以及红色。从制备的量子点的荧光光谱可以看出,其波谱谱峰呈对称高斯分布,且其半峰宽除了500 nm处的绿色量子点外,其余均在30～35 nm,这与文献报道的结果一致,与此同时也说明制备的量子点粒径均一。

图2 不同发射波长的量子点实物图及荧光光谱图

3.3 线性检测结果分析

三聚氰胺定量检测结果如图3所示,其中图3a为三聚氰胺定量检测实物图。

图3 三聚氰胺线性检测结果

从图3可以看出，随着三聚氰胺目标物质量浓度提高,检测线(T线)线条的荧光强度逐渐减弱,并且当目标物质量浓度达到10 ng/mL时检测线(T线)处基本观察不到荧光线条,这说明检测目标物质量浓度在10 ng/mL达到基于竞争法原理检测的消线值,即10 ng/mL为三聚氰胺的肉眼检测限;从图3b中可以看出随着目标物质量浓度的提高,检测线(T线)处的峰面积越来越小,并且在10 ng/mL处峰面积基本为0,这与图3a中检测线(T线)的变化趋势一致,进一步说明三聚氰胺肉眼检测限为10 ng/mL。图3c是根据图3b处检测线(T线)得到峰面积值拟合的线性曲线,从曲线的变化趋势可以看出,随着目标物质量浓度的提高,检测线(T线)的峰面积逐渐降低,这一变化趋势符合竞争法试纸条检测原理,故最终得到基于量子点荧光试纸条法检测三聚氰胺的肉眼检测限为10 ng/mL。

3.3 特异性检测结果分析

试纸条对目标物检测的特异性是免疫层析检测技术中首要考虑的一个重要指标,也是评判一个检测体系是否可靠的重要手段之一,只有通过特异选择性的验证才能保证最终检测结果的准确性,从而避免因为物理性的非特异吸附或者化学性的同源性干扰而导致的假阳性结果。因此为了验证该量子点荧光免疫层析试纸条对三聚氰胺检测是否具有良好的特异性,本文分别选取以下几种含有氨基的物质来进行特异性的验证。其中阴性对照采用磷酸缓冲液PBS,阳性对照采用赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)以及(dATP),其中三聚氰胺标品稀释至50 ng/mL,赖氨酸、精氨酸、脱氧腺苷三磷酸(dATP)均稀释至100 mg/mL。特异性检测结果如图4所示。

图4 三聚氰胺特异性检测

从图4a中可以直观看出,在紫外暗箱中,滴加了三聚氰胺检测液的试纸条只出现了质控线(C线),没有出现检测线(T线),其余几组均出现了检测线(T线)和质控线(C线),这说明50 ng/mL 检测质量浓度已经完全达到基于竞争法检测原理的消线值,故该质量浓度处无检测线(T线)出现,而其余阳性对照组即使在其稀释倍数为三聚氰胺稀释倍数2 000倍的情况下依旧没有消线,说明该方法对于阳性组的几种物质没有识别能力。图4b是根据图4a中的检测线(T线)处的峰面积值得出的特异性柱状图,从图4b中可以看出,三聚氰胺检测组的峰面积值远小于其他检测组的峰面积值,这进一步说明了该方法对三聚氰胺具有良好的选择识别性。由此可以说明,本检测方法不受其他氨基类化合物的干扰,具有极好的特异性,可用于实际样品的检测。

3.4 实际样品检测结果分析

在不同反应体系中检测得到的结果如图5所示,其中图5a是定量检测反应体系即磷酸缓冲液PBS反应体系,从图5a中可以看出,其肉眼检测限为10 ng/mL;图5b 为模拟实际样品检测体系,即将不同量的三聚氰胺标准样品加入牛奶中制成实际样品检测液上样后得到的检测结果,从图5b中可以看出,实际样品检测液的肉眼检测限为20 ng/mL,其肉眼检测限比定量检测体系的检测限低,这主要是由于实际样品检测液的稀释液相当于牛奶,而定量检测体系的稀释液是磷酸缓冲液,其成分较单一,后者成分较复杂。正由于稀释体系的复杂化使得实际样品检测体系在检测时受到稀释液中其他复杂成分的干扰，从而使其检测灵敏度降低,但是总体而言两者检测灵敏度相差不大,并且都能达到文献[12]的标准因此说明该方法可以应用于实际样品检测。

图5 三聚氰胺实际样品检测

4 结 论

传统的胶体金免疫层析技术是以胶体金为标记物发展而来的一项快速检测技术[13]。由于其具有高效性、快速性、简便性,在现场筛查、高通量快速检测中得以广泛应用。但是由于胶体金粒径比较大、金颗粒容易聚集,在检测时有时无法达到要求的高灵敏度。

本实验采用自制备水溶性量子点作为免疫层析试纸条中的标记物,研发出一种基于量子点的荧光免疫层析试纸条法，并将其用于非法添加物三聚氰胺的检测。实验对三聚氰胺进行了快速、定量、高灵敏的检测,并对最终的检测结果进行了分析,得出该荧光试纸条检测三聚氰胺的肉眼检测限能够达到10 ng/mL,检测时间只需10 min,同时结果表明该试纸条检测具有良好的特异性。此外,这种新的检测技术可以实现三聚氰胺现场检测,有望在疾病的社区筛查中得到广泛应用。

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[12] 中华人民共和国卫生部,中华人民共和国工业和信息化部,中华人民共和国农业部,等.关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告(2011年第10号)[EB/OL].(2011-04-06).http://www.miit.gov.cn/n11293472/n11293832/n12845605/13722833.html.

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QDs-basedfluorescenceimmunochromatographiclateralflowteststripsforrapiddetectionofmelamine

ZHAO Diping1, CHENG Kewen2, CHENG Lin1, PAN Daodong2, JIANG Yuan1,3

(1.School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2.School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 3.Animal, Plant and Food Inspection Center， Jiangsu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau， Nanjing 210001, China)

The synthesis of water-soluble quantum dots(QDs) was done and a new QDs-based fluorescence immunochromatographic lateral flow test strip detection method was established and then used to achieve the detection of illegal food additive: melamine. The experimental results showed that the detection limit for melamine by this strip was 10 ng/mL and the detection could be finished within 10 min. The strip is time-saving, easy to perform and relatively inexpensive. It is ideally suited for rapid on-site detection of melamine.

melamine; quantum dots(QDs); immunochromatographic test strip; rapid detection

2016-02-29；

2016-04-13

赵弟萍(1989-),女,甘肃兰州人,合肥工业大学硕士生; 蒋 原(1982-),男,江苏南通人,博士,合肥工业大学教授,博士生导师.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.10.023

R155.51

A

1003-5060(2017)10-1420-06

(责任编辑 闫杏丽)