利用FACS定量研究脂肪组织中肥大细胞的数目

张 磊, 刘 健

(合肥工业大学 生物与医学工程学院,安徽 合肥 230009)

利用FACS定量研究脂肪组织中肥大细胞的数目

张 磊, 刘 健

(合肥工业大学 生物与医学工程学院,安徽 合肥 230009)

肥胖会导致脂肪组织中各种免疫细胞数量的失衡,肥大细胞(MCs)在肥胖个体的脂肪组织中数量明显增多,而MCs稳定剂木犀草素(LU)可以降低高脂饮食小鼠附睾脂肪组织(EAT)中MCs的数量,并改善肥胖和胰岛素抵抗的发展。此前的研究是利用甲苯胺蓝染色半定量EAT中MCs数量的变化。甲苯胺蓝染色的特异性和统计精密度都存在一定的欠缺,为了更精确地研究在肥胖过程中脂肪组织中MCs数量的变化,文章建立了高精密度的流式细胞荧光分选(fluorescence activated cell sorting,FACS)技术,并研究了低脂、高脂和高脂补充LU组小鼠EAT中MCs变化情况。FACS分析定量结果显示,MCs在高脂饮食诱导下明显升高,而饮食补充LU可以明显降低MCs的数目。另外,EAT中MC蛋白酶的定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结果也支持了FACS分析的结果。因此,利用FACS分析脂肪组织中MCs数目的精确变化,为进一步研究MCs在肥胖中的作用机制提供技术支持。

木犀草素(LU);肥大细胞(MCs);肥胖;流式细胞术;附睾脂肪组织

肥胖是一种慢性低度的炎性疾病。脂肪组织尤其是内脏脂肪组织中各种免疫细胞的失衡,分泌大量的促炎性细胞因子,引发一系列相关的代谢综合症[1-2]。肥大细胞(MCs)在过敏和炎性疾病中起重要的角色,广泛分布于皮肤及内脏黏膜下的微血管周围,受到过敏原的刺激后会快速发生脱颗粒释放介质介导过敏反应。MCs还参与了肥胖及其相关的代谢疾病的调控。MCs在肥胖个体的脂肪组织中大量聚集[3-5]。药物稳定或基因缺失MCs可以有效地抵抗小鼠高脂饮食诱导肥胖及其相关的胰岛素抵抗的发生[4]。木犀草素(LU)是一种高效的天然黄酮类MCs稳定剂[6],广泛分布于各种食用性植物和药用植物中[7]。LU不仅可以抑制IgE介导的MCs产生的参与过敏反应递质释放[8],而且可以显著性降低脂肪细胞分化[9]和高脂饮食诱导的小鼠体重和脂肪组织重量的增加[10]。

研究发现LU能够降低高脂饮食诱导的小鼠附睾脂肪组织(EAT)中MCs的聚集,但检测方法是半定量的甲苯胺蓝组织化学染色,精确度上存在一定的缺陷,并且只能分析组织局部情况,不能很好反映整体组织中MCs数量的变化。流式细胞荧光分选(fluorescence activated cell sorting,FACS)技术是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段,具有速度快、精度高、准确性好等优点。因此本文利用该技术,以LU可以降低高脂饮食小鼠EAT中MCs的聚集为模型来定量分析MCs数量的变化,为进一步研究MCs在肥胖中的作用机制提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

C57BL/6雄性4周龄SPF级小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司;LU(>98%HPLC,上海华壹生物科技有限公司);Mac2抗体(BioLegend); PE anti-mouse CD45、APC anti-mouse CD117和PE-Cy7 anti-mouse Fc.εR1购于eBioscience;Trizol 试剂盒(TaKaRa);逆转录试剂盒(Invitrogen);SYBR Green MIX(Bio-Rad公司);无水乙醇等常规生化试剂(国药集团)。

1.2 仪器与设备

流式细胞仪MoFlo XDP(Beckman Coulter);组织脱水机TKY-TSH (亚光);石蜡包埋YB-6LF (亚光);组织切片机RM2235 (德国Leica);IQ5荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠饲养

小鼠饲养于SPF级恒温25 ℃动物房,12 h/12 h光暗周期。将5周龄小鼠随机分为3组(每组8只),即给于低脂饮食(research diets D12450B,10%能量源于脂肪)的正常对照组、给予高脂饮食(research diets D12451,45%能量源于脂肪)的肥胖模型组和给予添加0.01%的LU高脂饮食的处理组。喂养20周后处死收取组织。

1.3.2 甲苯胺蓝组织化学染色

EAT固定于4%中性甲醛后常规脱水石蜡包埋、切片及复水;复水后的切片放入蒸馏水中洗5 min;切片放入体积分数为0.5%甲苯胺蓝水溶液中,室温染色 2 h;自来水中洗去表面染液;用体积分数为5%乙酸水溶液中分色1 min;分色后的切片迅速放于蒸馏水洗3次,每次5 min;将切片置于室温中自然凉干;切片浸入二甲苯中透明3 min透明;中性树胶封片后放入70 ℃烘箱内烘干;在光学显微镜下进行统计MCs数目并拍摄图片,并计算每平方毫米MCs的数目。

1.3.3 FACS技术

用CO2窒息小鼠后,取EAT并称重,用剪刀将其剪成细小碎块,转移到1.25 mg/mLⅡ型胶原酶溶液中,2.5 mg胶原酶每克组织;37 ℃,80 r/min消化25 min;加入预冷的0.5% BSA的PBS以终止反应,用200目的滤网过滤,过滤下液体转移到新的离心管中;4 ℃,400 g离心4 min弃上清;用红细胞裂解液裂解去除红细胞;利用含0.5% BSA的PBS清洗细胞,4 ℃,400 g离心4 min后定容到50 μL,加入0.25 μL的Fc Block,冰上静止15 min。加入抗体,PE-CD45 0.15 μL/50 μL、PE-CY7-Fc.εR1 0.25 μL/50 μL、APC-CD117 0.25 μL/50 μL,冰上反应90 min;用0.5% BSA的PBS清洗细胞,4 ℃,400 g离心4 min,弃上清,定容到300 μL后直接上机检测。

1.3.4 总RNA的提取、反转录及定量PCR

EAT的总RNA提取、反转录及定量PCR的方法参考文献[11]。定量PCR引物详细序列见表1所列。

表1 定量PCR引物序列

2 结果与分析

2.1 甲苯胺蓝组织化学染色结果分析

5周龄小鼠随机分为3组,分别给予低脂、高脂和高脂补充LU饮食喂养20周。EAT中Mcs的甲苯胺蓝组织化学染色结果如图1、图2所示。

图1 EAT中MCs的甲苯胺蓝组织化学染色

图2 EAT中MCs甲苯胺蓝染色定量分析

通过对EAT中肥大的甲苯胺蓝组织化学染色发现高脂组小鼠EAT中的MCs数量显著多于低脂组小鼠。另外,相比于高脂组小鼠,高脂+LU组小鼠能明显降低EAT中的MCs,该结果与之前报道相一致[9]。因此,通过组织化学染色发现饮食补充LU可以抑制高脂饮食诱导MCs在EAT中的聚集。

2.2 FACS分析结果

通过MCs的甲苯胺蓝染色及定量结果可知,LU降低高脂饮食小鼠EAT中MCs的实验模型是成功的。由于甲苯胺蓝对MCs染色是非特异的,并且统计精确度不高。为了解决该问题,本文利用更高精密度的FACS来分析EAT中的MCs数目的变化。

首先,用胶原酶将EAT进行消化去除成熟的脂肪细胞以分离出间质细胞,再利用交联不同荧光素抗小鼠的抗体PE-CD45 、PE-CY7-Fc.εR1 和APC-CD117标记间质细胞中的MCs。先用FACS中的前向和侧向去除间质细胞中的细胞碎片,再圈出CD45阳性的细胞,最后圈出CD117和Fc.εR1双阳性的细胞即为MCs,如图3所示。

图3 FACS分析EAT中MCs

通过定量计算得到MCs在间质细胞中所占百分比和每克脂肪组织中MCs的绝对数量，如图4 所示,结果显示高脂组小鼠EAT中MCs在间质细胞中所占的比例和绝对数量都明显提高,而高脂+LU组小鼠明显反转高脂饮食诱导的结果。因此,流式结果不仅能显现出MCs在间质细胞中比例的变化,而且还能定量得出每克组织中所含MCs总数的改变。

通过分析甲苯胺蓝染色和FACS分析定量MCs结果的相关性,甲苯胺蓝染色定量的每平方毫米组织中MCs的数目与FACS定量的每克脂肪组织中MCs的个数呈正相关。说明FACS能够很好地定量脂肪组织中MCs的数量,如图5所示。

Mcp是MCs分泌的重要介质,也是作为MCs的重要标记基因。利用定量PCR检测了低脂组、高脂组和高脂+LU组小鼠EAT中Mcp4和Mcp6的mRNA表达水平,如图6所示,相比于低脂组小鼠,高脂组小鼠EAT中Mcp4和Mcp6的表达显著性升高,然而LU处理可以明显逆转MC蛋白酶的升高。这一结果与FACS分析一致,饮食补充LU可以抑制高脂饮食小鼠EAT中MC蛋白酶的升高。因此,FACS技术能够很好地分析EAT中MCs数量的变化。

图4 FACS 定量 EAT中MCs的数目

图5 MCs甲苯染色与FACS定量的相关性

图6 EAT中MC蛋白酶的表达

3 结 论

MCs在肥胖及其相关的胰岛素抵抗的产生中起重要作用,天然黄酮类化合物LU可以有效地抑制MCs的活性,并能够抵抗高脂饮食诱导的小鼠肥胖和胰岛素抵抗的发展。之前报道发现通过甲苯胺蓝染色结果显示LU可以降低高脂饮食小鼠EAT中MCs的聚集。本文基于甲苯胺蓝染色存在一定欠缺,以饮食补充LU可以降低高脂饮食小鼠EAT中MCs 数量为模型,利用更高精密度的FACS分析定量EAT中MCs的数目。FACS的结果显示MCs在高脂饮食诱导下明显升高,而LU的饮食补充可以明显降低MCs的数目。因此,FACS分析更能精确反映出EAT中MCs在间质细胞中的比例和每克组织中的总数变化。通过FACS分析脂肪组织中MCs数目,为进一步研究MCs在肥胖中的作用机制提供参考。

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QuantitativestudyofmastcellsinadiposetissueusingFACS

ZHANG Lei, LIU Jian

(School of Biological and Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Obesity leads to the imbalance of immune cells in adipose tissue. Mast cells(MCs) significantly increase in adipose tissue of obese individuals. Luteolin(LU), a MCs stabilizer, reduces diet-induced body weight gains and insulin resistance in mice. It was reported that LU decreased the aggregation of MCs in epididymal adipose tissue(EAT) in high fat diet(HFD) -fed mice by toluidine blue staining. Toluidine blue staining is a semi-quantity assay and nonspecific for MCs. In this paper, in order to study MCs in adipose tissue in the obese state more precisely, MCs in EAT from low fat, high fat and high fat supplement LU diets-fed mice were detected by high precision fluorescence activated cell sorting(FACS) of flow cytometry. The results of FACS analysis showed that MCs obviously increased in EAT in HFD group mice and significantly reduced in EAT in LU-fed mice. Moreover, the changes of mRNA levels of MC proteases measured by polymerase chain reaction(PCR) supported the results of FACS analysis. Consequently, FACS analysis for MCs can provide technical support for further study of the function mechanism of MCs in obesity.

luteolin(LU); mast cells(MCs); obesity; flow cytometry; epididymal adipose tissue(EAT)

2016-03-09；

2016-04-15

国家自然科学基金资助项目(31171315)

张 磊(1987-),男,安徽六安人,合肥工业大学博士生; 刘 健(1970-),男,安徽合肥人,博士,合肥工业大学教授,博士生导师.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.10.022

Q291

A

1003-5060(2017)10-1416-04

(责任编辑 闫杏丽)