新型载HIF-1α反义寡核苷酸微泡联合超声对肿瘤生长的抑制作用

钟 渝 赵 洋 高顺记 刘 政

新型载HIF-1α反义寡核苷酸微泡联合超声对肿瘤生长的抑制作用

钟 渝1赵 洋2高顺记2刘 政2

目的血管毁损术治疗肿瘤后，肿瘤血管均有不同程度的再生，导致肿瘤坏死不彻底，其核心可能与HIF-1α的高表达有关。本研究探讨采用载HIF-1α反义寡核苷酸微泡联合超声抑制肿瘤生长的可行性。材料与方法24只荷皮下VX2肿瘤的新西兰大白兔随机分为新型微泡超声组（n=8）、普通微泡超声组（n=8）和单纯超声组（n=8）。新型微泡超声组经耳缘静脉推注载HIF-1α反义寡核苷酸微泡联合超声辐照，普通微泡超声组和单纯超声组分别以普通微泡、生理盐水代替。每次10 min，每72 h治疗一次，采集各时间点肿瘤二维超声图像，测量肿瘤切面最大直径。结果在30 d的实验周期内，新型微泡超声组、普通微泡超声组和单纯超声组的肿瘤平均直径由（1.13±0.19）cm、（1.17±0.21）cm、（1.22±0.17）cm 生长至（1.60±0.45）cm、（2.11±0.57）cm、（3.43±0.71）cm。治疗前，3组肿瘤平均直径差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，新型微泡超声组肿瘤生长最缓慢，直径显著小于普通微泡超声组和单纯超声组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论采用载HIF-1α反义寡核苷酸微泡联合超声治疗可以明显增强普通微泡超声的血管毁损作用，有望成为一种新的肿瘤治疗方法。

空化；HIF-1α反义寡核苷酸；微泡，肿瘤

近年来，以“超声空化”为核心的血管毁损术实现兔皮下VX2肿瘤、大鼠皮下Walker-256肿瘤微循环的研究，其目标是彻底阻断肿瘤微循环，进而“饿死”肿瘤，从而实现治疗肿瘤[1-5]。然而，进一步研究发现血管毁损术治疗肿瘤48 h后，部分肿瘤有新生血管再次长入现象，且随着观察期延长，其肿瘤血管的再通越明显，导致肿瘤坏死不彻底[5]。研究发现，在缺血缺氧条件下，缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）的高表达在超声联合微泡对肿瘤血管毁损治疗后的血管再通和血管新生过程中可能具有决定性作用[6-7]。因此，本研究拟采用携带HIF-1α反义寡核苷酸（antisense oligodexynucleotides，ASODN）的新型微泡联合超声治疗兔VX2皮下移植瘤模型探讨其抑制肿瘤生长的可行性，以进一步完善血管毁损术。

1 材料与方法

1.1 实验动物及设备 健康新西兰白兔24只（合格证号SCXK-2012-2009），均为雄性，体重2.0～2.5 kg，由第三军医大学附属新桥医院动物实验中心提供。VX2肿瘤组织匀浆由第三军医大学新桥医院提供，日本协和发酵株式会社赠送。深圳市威尔德医疗电子有限公司新型超声治疗仪（型号DCT-700），其治疗头直径2.3 cm，探头频率1.2 MHz，峰值3439 kPa，脉冲重复频率10 Hz，占空比为0.2%，平均声强1.2 W/cm2。Logic9超声诊断仪，9L高频线阵探头，配有超声造影成像模式及超声造影分析软件。“脂氟显”微泡造影剂由第三军医大学附属新桥医院提供，核心气体为全氟丙烷，外观为乳白色凝乳状，平均粒径2 μm，其中98%＜8 μm，浓度约为7×109/ml；速眠新II注射液为军事医学科学院军事兽医研究所研制。

1.2 实验步骤

1.2.1 制备新型载HIF-1α ASODN脂质微泡 ①制备含生物素修饰PEG末端、包载HIF-1α ASODN的脂质体；②制备含丰富生物素修饰PEG末端的新型脂膜微泡；③以亲和素为中间连接体，制备耦连HIF-1α ASODN脂质体的脂膜微泡。

1.2.2 建立荷VX2皮下移植瘤模型 采用速眠新II注射液将皮下荷VX2肿瘤兔以0.15 ml/kg肌肉注射麻醉，固定于实验台上，用8%硫化钠脱毛，充分暴露肿瘤区，碘伏消毒，于无菌条件下，取出肿块置于无菌生理盐水中，选取鱼肉状有活力的肿瘤组织剪成1 mm3的小块，分别接种于已麻醉的24只健康新西兰大白兔右后腿外侧皮下。

1.2.3 动物分组及治疗方法 将建模后的新西兰大白兔随机分为3组，即24只荷皮下VX2肿瘤的新西兰大白兔随机分为新型微泡超声组（n=8）、普通微泡超声组（n=8）和单纯超声组（n=8）。治疗前一天应用常规二维超声及彩色多普勒血流显像检查肿瘤，二维声像图上采集最大切面肿瘤直径，选择血供较丰富的肿瘤切面固定采集影像。新型微泡超声组经耳缘静脉推注载HIF-1α反义寡核苷酸微泡（0.2 ml/kg）联合超声辐照，普通微泡超声组、单纯超声组分别以普通微泡、生理盐水代替。每次10 min，每72 h重复治疗一次，直到观察期30 d结束。

1.2.4 肿瘤生长抑制效果评价采集治疗前及治疗后各时间点肿瘤二维超声图像和超声造影影像，测量肿瘤切面最大直径，观察肿瘤大小及坏死情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0软件，计量资料以±s表示，治疗前、后各时间点各组肿瘤大小比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型建立 24只新西兰大白兔均成功建立皮下荷VX2肿瘤抑制模型，肿瘤直径1.0～1.5 cm。观察期内无一例死亡。

2.2 肿瘤生长抑制结果 治疗前，新型微泡超声组、普通微泡超声组、单纯超声组肿瘤大小差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后第15天和第30天，新型微泡超声组、普通微泡超声组肿瘤直径均小于单纯超声组，差异有统计学意义（P＜0.05）；新型微泡超声组肿瘤直径均小于普通微泡超声组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 1～3。

图1 不同实验组治疗后肿瘤直径比较

图2 新西兰大白兔皮下荷VX2肿瘤生长抑制曲线

图3 各组荷VX2肿瘤新西兰大白兔皮下不同时间点肿瘤二维超声切面图。A～C为新型微泡超声组治疗前、治疗后第15天、治疗后第30天二维超声肿瘤最大切面；D～F为普通微泡超声组治疗前、治疗后第15天、治疗后第30天二维超声肿瘤最大切面；G～I为单纯超声组治疗前、治疗后第15天、治疗后第30天二维超声肿瘤最大切面

3 讨论

近年来，血管毁损术作为一种新的、具有潜在广阔应用前景的治疗方法成为研究热点[1-4]，其根本在于以“先天缺陷”肿瘤新生血管为靶点，肿瘤发生、发展需要氧气和营养，多数肿瘤细胞的转移也需要通过邻近血管，因此如果阻断肿瘤组织内的血管，理论上就可以抑制肿瘤细胞生长，降低转移几率[8]。既往研究发现，经静脉注射脂质微泡超声造影剂联合超声空化治疗技术，可有效阻断兔皮下VX2肿瘤的微循环长达24 h[2-3]。然而，血管毁损术治疗肿瘤3～10 d后，部分肿瘤有新生血管再次长入现象，导致肿瘤坏死不彻底，成为该疗法的瓶颈[5]。HIF-1α表达增加是机体的一种适应性反应，在血管毁损术治疗过程中，肿瘤微血管在短时间内被迅速毁损阻断，造成肿瘤细胞急性缺血缺氧，HIF-1α表达及活性可能均显著增强；同时在缺氧条件下，HIF-1α诱导转录的抑制因子——林希病肿瘤因子（product of von hippel-lindau disease，pVHL）和缺氧诱导因子抑制因子（factor inhibiting hypoxia-inducible factor-1，FIH-1）均几乎失去降解HIF-1α的能力[9-10]。这就导致HIF-1α在肿瘤组织内大量堆积，一方面可能与缺氧产生的自由基等因子共同作用，诱导环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）产生，进而催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质，使肿瘤及周围组织血管扩张、血流量增加，促进不稳定的微血栓迅速溶解。此外，高表达的HIF-1α和COX-2均可通过上调血管内皮生长因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）的表达，促进肿瘤血管新生[7]。因此，HIF-1α在超声联合微泡对肿瘤血管毁损治疗后的血管再通和血管新生过程中可能具有决定性作用，在血管毁损术基础上探索一种降低肿瘤细胞HIF-1α表达进而抑制肿瘤血管新生的方法具有重大意义。

本研究采用一种耦连HIF-1α ASODN脂质体的新型微泡替代普通脂质微泡，在超声击破微泡毁损肿瘤新生血管的同时靶向释放HIF-1α ASODN以抑制肿瘤组织在缺氧条件下HIF-1α的高表达，进而抑制VEGF的表达，以巩固微泡增强超声对肿瘤新生血管的阻断效果，减少肿瘤血管再通和血管新生。该新型微泡除采用目前较成熟的具有高度特异性和低毒性的基因干预手段ASODN技术，同时充分利用微泡本身的“空化核”特性，实现了在肿瘤靶位的有效释放：一方面在超声空化作用下微泡可以引起邻近细胞膜短暂地形成可逆性小孔，称为“声孔效应”；另一方面微泡破裂时产生的冲击波、高速微射流等可以使细胞的内吞作用显著增强，加速目的基因进入细胞，从而增强基因转染与表达[11]。赵洋等[5]研究发现，普通微泡超声能有效实现肿瘤生长抑制，本研究再次证实这一结果。在此基础上，新型微泡联合超声组较普通微泡超声组更显著而有效地实现了抑制肿瘤生长，观察期末二维超声显示其肿瘤体积明显小于普通微泡超声组，进一步证实其能够抑制肿瘤血管新生及再通。

本研究存在一些不足之处：①本研究中VX2肿瘤来源于Shope病毒致乳头瘤恶变形成的上皮细胞恶性肿瘤，属于鳞状细胞癌，虽然可以代表一般肿瘤模型，但不能代表临床所有肿瘤模型，尚不具有普遍性；②本研究观察随访期仅为30 d，时间较短，未观察动物的完整生存期；③本研究尚未对超声发射参数和治疗的重复频率等条件进行优化，对新型微泡联合超声的最优参数组合等有待进一步深入研究。同时本研究发现，在新型微泡联合超声抑制肿瘤的生长过程中，肿瘤仍较缓慢地生长，说明肿瘤血管的再通可能存在其他机制需要进一步探讨。

总之，新型载HIF-1α ASODN微泡联合超声能有效而确切地抑制肿瘤生长，未来有望成为一种新的无创治疗肿瘤的方法。

[1]钟渝,刘政,朱梅,等.新型超声空化技术毁损大鼠Walker-256肿瘤微血管的研究.中华医学杂志,2012,92(7):487-490.

[2]朱梅,李佩倞,钟渝,等.低能量脉冲式超声联合微泡对兔VX2肿瘤微循环的阻断作用.中国医学影像技术,2012,28(4): 621-625.

[3]钟渝,刘政.微泡增强的超声空化阻断肿瘤微循环的病理观察.中国医学影像技术,2015,31(8): 1131-1134.

[4]Liu Z,Gao S,Zhao Y,et al.Disruption of tumor neovasculature by microbubble enhanced ultrasound: a potential new physical therapy of anti-angiogenesis.Ultrasound Med Biol,2012,38(2): 253-261.

[5]赵洋,高顺记,刘政,等.超声击破微泡效应抑制兔VX2肿瘤生长的实验研究.中华超声影像学杂志,2010,19(4):352-355.

[6]Baysal BE.A phenotypic perspective on mammalian oxygen sensor candidates.Ann N Y Acad Sci,2006,1073(1): 221-233.

[7]Daneau G,Boidot R,Martinive P,et al.Identification of cyclooxygenase-2 as a major actor of the transcriptomic adaptation of endothelial and tumor cells to cyclic hypoxia:effect on angiogenesis and metastases.Clin Cancer Res,2010,16(2): 410-419.

[8]Folkman J.Angiogenesis and apoptosis.Semin Cancer Biol,2003,13(2): 159-167.

[9]Min JH,Yang H,Ivan M,et al.Structure of an HIF-1alphapVHL complex: hydroxyproline recognition in signaling.Science,2002,296(5574): 1886-1889.

[10]Lee C,Kim SJ,Jeong DG,et al.Structure of human FIH-1 reveals a unique active site pocket and interaction sites for HIF-1 and von Hippel-Lindau.JBiolChem,2003,278(9):7558-7563.

[11]Meijering BD,Juffermans LJ,van Wamel A,et al.Ultrasound and microbubble targeted delivery of macromolecules is regulated by induction of endocytosis and pore formation.Circ Res,2009,104(5): 679-687.

（本文编辑 周立波）

Microbubbles with HIF-1αAntisense Oligonucleotide Enhanced Ultrasound on Inhibition of Tumor Growth

ZHONG Yu ZHAO Yang GAO Shunji LIU Zheng

PurposeAfter the angiotripsy treatment of tumor,tumor blood vessels have different degrees of regeneration,leading to incomplete tumor necrosis,which may be related to the high expression of HIF-1α.To explore the feasibility of microbubble with HIF-1α antisense oligonucleotide combined with ultrasound inhabit tumor growth.Materials and MethodsTwenty-four rabbits with VX2 tumor were randomly assigned to three groups: microbubbles with HIF-1α antisense oligonucleotide plus ultrasound(HMB+US) (n=8),microbubbles plus ultrasound (MB+US) (n=8),therapeutic ultrasound alone without microbubbles (US) (n=8).Pulsed focused ultrasound was delivered directly to the tumor surface for 10 minutes during intravenous infusion of microbubbles with HIF-1α antisense oligonucleotide in the experimental group.The control groups were applied only microbubbles or saline injection.The procedure was repeated every 72 hours until the 30th day.Contrast enhanced US and grey scale ultrasonography were acquired after every treatment to get the tumor perfusion images,size and volume measurements.ResultsThe average maximum diameter of the HMB+US,MB+US,and the US groups grows from(1.13±0.19) cm,(1.17±0.21) cm,(1.22±0.17) cm to (1.60±0.45) cm,(2.11±0.57) cm,(3.43±0.71) cm within a 30d-experimental period,respectively.No statistical difference in average diameter was observed among three groups before treatment (P＞0.05).The average maximum diameter of the HMB+US group was significantly smaller than that of the two control groups at the end of experiment (P＜0.05),and the average maximum diameter of the MB+US group was significantly smaller than that of the US group (P＜0.05).ConclusionMicrobubbles with HIF-1α antisense oligonucleotide can enhance vascular damage effect of angiotripsy,which can be a novel method for tumor treatment.

Cavitation; HIF-1α antisense oligonucleotide; Microbubble,tumor

10.3969/j.issn.1005-5185.2017.10.002

1.解放军324医院肾病科 重庆 400020

2.第三军医大学附属新桥医院超声科 重庆400037

刘 政

Department of Ultrasound,Xinqiao

Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400037,China

Address Correspondence to:LIU Zheng

E-mail: liuzhengs@126.com

重庆市基础与前沿计划项目

（cstc2013jcyjA0913）；成都军区医学科学技术研究计划面上项目（C14022）

R454；R73-3

2017-05-27

修回日期：2017-07-22

中国医学影像学杂志

2017年 第25卷 第10期：726-728，733

Chinese Journal of Medical Imaging 2017 Volume 25 (10): 726-728,733