牛血清小分子肽的分离

◎秦静怡 陈丹娜 徐倩

牛血清小分子肽的分离

◎秦静怡 陈丹娜 徐倩

目的：从牛血清中分离出小分子肽。方法：将胎牛血清串联超滤得到分子质量1k-3kDa的组分；将超滤浓缩组分作葡聚糖凝胶G-25层析，收集对应吸收峰的洗脱液；C18RP-HPLC脱盐纯化洗脱液样品后质谱仪检测。结果：血清1k-3kDa的超滤浓缩组分洗脱液有2个吸收峰，收集到吸收峰1对应的洗脱液，经C18RP-HPLC纯化后质谱仪检测，结果显示内有纯度较高的分子质量为1794Da的肽。结论：牛血清分子质量1k-3kDa组分内含有含量较高的小分子肽。

血清中含有大量来源广泛的小分子肽，其中大部分与载体蛋白结合，这就造成小分子肽的分离纯化较难进行。近年研究表明，血清中小分子肽很多都具有生理作用或药理作用。笔者发现分子质量5kDa以下的肽相关研究较少，故本研究试图从牛血清中分离小分子肽，以期能确定一种或几种小分子肽结构和名称，鉴定其生物活性，并探讨其作用机制。

材料与方法

材料与试剂

胎牛血清(四季青公司)，葡聚糖凝胶G-25型(安玛西亚公司)，三羟甲基氨基甲烷（Sigma公司），分析纯冰醋酸（上海生工）

仪器与设备

MILLIPORE 8400超 滤 杯（MILLIPORE公司 ），RMM3000超滤膜（MILLIPORE公司），79-1型磁力搅拌器（中国江苏金坛市望华科教仪器厂），SC100A Speedvac Plus真空冷冻干燥机（Thermo Savant公司），超低温冰箱 （美国Forma Scientific），721型分光光度计（中国上海）

方法

串联超滤。超滤杯消毒后正常安装，预处理滤膜，无菌条件下将200ml胎牛血

清倒入杯内，在2.5MPa的N2气气压下，用截留分子质量MWCO为3kDa的超

滤膜与截留分子质量MWCO为1kDa的超滤膜在低温下进行串联超滤，收集分

子质量1k-3k Da的超滤浓缩组分5～10ml，除菌过滤，低温保存。

葡聚糖凝胶 G-25层析。预处理凝胶，装柱，凝胶表面预留约3cm左右的洗脱液。调节层析柱下端出口，使得洗脱液洗流速约为1ml/min，分别检测出胸腺肽α（分子质量3108Da）和催产素（分子质量1007Da）在215nm下的吸收峰出现时间。以胸腺肽α和催产素吸收峰出现时间为参照，确定血清1k-3kDa的超滤浓缩组分吸收峰出现时间，收集吸收峰的洗脱液，真空冷冻干燥。

C18RP-HPLC脱盐纯化及质谱分析。将冻干样品用蒸馏水溶解，调整乙腈洗脱浓度梯度，进行RP-HPLC，收集洗脱峰，并用通过质谱仪鉴定洗脱峰中物质。

图1 C18RP-HPLC吸收峰成分的质谱分析

结果与讨论

结果

葡聚糖凝胶 G-25层析。以胸腺肽α和催产素吸收峰出现时间为参照，血清1k-3kDa的超滤浓缩组分在37min开始出现第一个吸收峰，75min出现第二个吸收峰，实验中主要收集第一个吸收峰对应的洗脱液。

C18RP-HPLC质谱分析。将洗脱峰样品进行RP-HPLC，收集到吸光度最高的洗脱峰，并用通过质谱仪鉴定洗脱峰中物质。图2-1为脱峰中质谱图谱，显示其中含有分子量纯度较高分子量为1794Da的小分子肽。

讨论

血清小分子肽可以在很多生理过程中产生，又因为较易被吸收，常参与多种生理活动调节。本研究选择细胞培养常用的胎牛血清进行研究，因为在原代细胞培养中，不加细胞生长因子原代细胞会趋向一种类型细胞分化，这一现象可能意味着血清中一些小分子物质对细胞生长分化有影响。

实验葡聚糖凝胶 G-25层析结果显示，血清1k-3kDa的超滤浓缩组分内含有一些浓度较高的小分子肽。

C18RP-HPLC脱盐及分离收集单一洗脱峰，将洗脱峰收集起来质谱仪检测，发现里面含有一种纯度较高的小分子肽，分子量为1794Da，说明在血清血清1000-3000Da的超滤浓缩组分中间，这种肽类含量较高，且通过数据库查询，搜索不到相应的信息，极有可能是新发现的肽。

湖南省教育厅课题，课题编号（12C0511）;湖南省高等学校科学研究项目，项目编号（12C0513）

（作者单位：长沙医学院基础医学院）