单一干酪乳杆菌KL1发酵益生菌酸奶工艺条件的研究

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(北京农学院食品科学与工程学院,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室, 食品质量与安全北京实验室,微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室,北京 102206)

单一干酪乳杆菌KL1发酵益生菌酸奶工艺条件的研究

张敏,张子豪,康建依,刘慧,谢远红,易欣欣,高秀芝*

(北京农学院食品科学与工程学院,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室, 食品质量与安全北京实验室,微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室,北京 102206)

应用单因素实验及正交实验,确定单一干酪乳杆菌KL1发酵酸奶的最佳原料乳,并对其益生菌酸奶发酵工艺条件进行优化。筛选得到的最佳原料乳为M2,同时通过添加M6改善酸奶的色泽与组织状态;采用三因素三水平L9(34)正交实验优化酸奶的发酵工艺条件,接种量是影响KL1发酵酸奶品质的最主要因素,确定干酪乳杆菌KL1发酵酸奶的优化条件如下:接种量为6.0%,M6添加量1.0%,葡萄糖添加量1.5%,37 ℃下发酵酸奶22 h,优化后的益生菌酸奶的活菌数量较对照组高10倍。

益生菌酸奶,干酪乳杆菌KL1,正交实验,感官评定

益生菌(Probiotics)是一类对宿主有益的活性微生物,是定植于人体肠道、生殖系统内,能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有:酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等[1]。益生菌具有良好的降低血清胆固醇[2]、促进肠道消化系统健康[3]、提高人体免疫力[4]等作用已经逐渐成为国际上的热门研究课题。乳制品尤其以酸奶为代表的发酵乳制品是益生菌最佳的载体之一。目前国内常用的酸奶主要是利用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵生产,该产品对人体胃肠酸环境耐受性较差,酸奶进人胃肠道后,成活率仅有0.065%和0.01%[5]。研究表明,在发酵乳制品中添加益生菌,除了保健功能外,还可改善发酵乳的风味和质地[6]。

干酪乳杆菌KL1来源于藏灵菇,该菌具有调节人体肠道酸碱度从而改善肠道中微环境的作用,还具有抗肿瘤、降血清胆固醇、增强人体免疫力等多种生理功能[7-9]。刘慧等[10]对干酪乳杆菌KL1中产胆盐水解酶乳酸菌降胆固醇作用机理方面的研究做出了突出贡献,郭志华等[11]对干酪乳杆菌KL1的益生特性做出进一步研究,张晶等[12]利用干酪乳杆菌KL1和乳酸菌制成降胆固醇蛋乳发酵饮料,张倩[13]等将其干酪乳杆菌KL1作为酸奶发酵剂进行分批发酵,但将单一干酪乳杆菌KL1直接用于发酵酸奶的研究尚未见文献报道。

因此,本研究以单一益生菌——干酪乳杆菌KL1作为发酵菌种,以感官评定指标、活菌数指标以及酸度等作为评价指标,应用不同品牌的原料乳发酵制备酸奶,以及确定KL1发酵酸奶的最佳原料乳;其次通过正交实验优化干酪乳杆菌KL1发酵益生菌酸奶的工艺条件。本研究将为干酪乳杆菌KL1的工业化生产提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

菌种 干酪乳杆菌KL1来源于实验室保藏菌种,-80 ℃冻存；原料 9种不同品牌原料乳或乳粉样品,分别编号为M1(三元极致低脂纯牛奶)、M2(三元纯牛奶)、M3(欧德堡超高温灭菌脱脂牛奶)、M4(欧德堡超高温灭菌高脂牛奶)、M5(伊利高蛋白脱脂高钙奶粉)、M6(伊利全脂甜奶粉)、M7(伊利纯牛奶)、M8(蒙牛高钙牛奶)、M9(蒙牛低脂高钙牛奶),其中M5和M6为乳粉；白砂糖、葡萄糖、NaOH、酚酞、MRS培养基、琼脂等；原料乳、乳粉及白砂糖 均购于超市,其它试剂 购于北京畅华志诚科技有限公司；培养基 改良MRS培养基[13](将MRS培养基中的鱼蛋白胨以0.5%的胰蛋白胨和0.5%乳酪蛋白水解物替代,其他成分不变),灭菌脱脂乳等。

MLS-3750全自动高压灭菌锅 日本三洋公司;GHP-9160型恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;BS224S型精密电子天平 德国赛多利斯公司;BCD-301型冰箱 青岛海尔股份有限公司;电磁炉 广东美的集团股份有限公司;BCN-1360B型无菌超净工作台 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;Scientz-11L 无菌均质器 宁波新芝生物科技有限公司;PHB-4便携式酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 菌种活化及发酵剂制备 先用改良MRS液体培养基活化干酪乳杆菌KL1,37 ℃培养18 h,然后将干酪乳杆菌KL1以3%的接种量接种于装有10 mL灭菌牛奶的试管中,振荡摇匀,于37 ℃培养至牛乳成凝固状态。如此传代培养至第3次,得到活化菌种,冷藏备用。

1.2.2 酸奶发酵单因素实验

1.2.2.1 发酵制备酸奶样品 分别将9种原料(m乳粉∶m水为1∶5复溶)经115 ℃杀菌15 min,加5%的白砂糖,冷却至42 ℃后接入4%干酪乳杆菌KL1发酵剂。分装,于37 ℃下培养22 h[14-15],转移至4 ℃冰箱中冷藏。将9种酸奶分别编号为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9。

1.2.2.2 酸奶中干酪乳杆菌KL1计数 分别取25 mL酸奶样品于225 mL灭菌生理盐水中,充分混匀,制成10-1的样品稀释液。取10-1样品液1 mL,沿管壁缓慢注于9 mL稀释液中,混合均匀,制成10-2的样品液,并依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释度的样品液。

分别取10-7、10-8、10-9稀释度的样品液1 mL,倾注MRS平板。每个梯度做3个平行,同时做空白对照。待琼脂凝固后,37 ℃倒置培养48 h,选取无蔓延菌落生长的平板用于计数,参照GB 4789.35-2010记录并计算Y1～Y9酸奶的干酪乳杆菌KL1菌数[16]。

1.2.2.3 酸奶的酸度测定 pH的测定:取各酸奶样品25 g,加入225 mL蒸馏水,混匀后,用pH计测定其pH。酸度的测定[17]:取各酸奶样品10 mL于150 mL三角瓶中,再加入20 mL蒸馏水和0.5 mL的0.5%酚酞溶液,摇匀,用0.1 mol/L(近似值)氢氧化钠溶液滴定至微红色,并在30 s内不褪色为止,记录0.1 mol/L(近似值)氢氧化钠所消耗的毫升数(A)。两次平行实验结果差值不得大于0.5°T。

吉尔涅尔度(°T)=A×F×10

式(1)

式(1)中:A-滴定时消耗的0.1 mol/L(近似值)氢氧化钠的毫升数;F-0.1 mol/L(近似值)氢氧化钠的校正系数;10-酸奶的稀释倍数。

1.2.2.4 酸奶的感官评价 酸奶感官评定小组为专业的评价人员构成,共有15人。采用描述性的检测方法分别对样品的组织状态、口感、气味和色泽进行细致的描述,评分标准采用百分制[17]。以感官评价的结果作为酸奶的评定标准,酸奶感官评定表如表1所示。

表1 酸奶感官评定表[19]Table 1 Yogurt sensory evaluation table[19]

表2 正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.2.5 最佳原料乳的确定 综合9种酸奶的活菌数、酸度以及感官评价的结果,确定最佳干酪乳杆菌KL1发酵酸奶的原料乳。

1.2.2.6 单因素酸奶发酵实验 应用1.2.2.5确定的原料乳,经115 ℃杀菌15 min,加5%的白砂糖,冷却至42 ℃后,分装,乳粉M6添加可改善酸奶的色泽与组织状态,单因素实验考察接种量、葡萄糖添加量与M6添加量三个因素对酸奶发酵的影响:固定M6添加量1.0%与葡糖糖添加量1.0%,考察不同KL1接种量(2.0%、4.0%、6.0%、8.0%)对酸奶感官品质的影响;固定M6添加量1.0%与接种量4.0%,考察不同葡萄糖添加量(0.5%、1%、1.5%、2%)对酸奶感官品质的影响;固定接种量4.0%与葡糖糖添加量1.0%考察不同M6添加量(0.5%、1%、1.5%、2%)对酸奶感官品质的影响。

1.2.3 酸奶发酵正交实验 基于该菌种的前期研究结果[14-15],在37 ℃条件下,干酪乳杆菌KL1可以高产胞外多糖和胆盐水解酶,牛乳凝固作为酸奶发酵的终止标志,因此本实验不再针对培养温度37 ℃和发酵时间进行发酵条件的优化。结合单因素实验结果,对接菌量、M6添加量以及葡萄糖添加量等影响因素进行正交实验分析,采用L9(34)正交实验设计,正交实验因素水平选择见表2,每组实验重复3次。对正交实验得到的酸奶分别进行酸度测定、感官评价以及活菌菌数测定。

正交实验验证实验中,普通发酵条件组合设为对照组,正交实验得到的感官指标优化组、活菌数量指标优化组以及正交实验感官最佳组作为验证组,验证比较酸奶最佳发酵条件的优越性。

1.3数据处理

利用Excel 2007和SPSS 18分析软件对数据进行统计分析,并结合Duncan氏法做多重比较,所有实验均重复三次,结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1干酪乳杆菌KL1发酵酸奶样品中活菌数量、酸度及pH

干酪乳杆菌KL1发酵原料乳样品制备酸奶,9种酸奶样品活菌数量、酸度及pH测定结果如表3所示,9种酸奶益生菌的活菌数量均在8.0 log CFU/g以上,其中Y2和Y6酸奶活菌数量显著高于其它7种酸奶的活菌数量,活菌数量达到9.0 log CFU/g以上,根据统计数据分析Y2与Y6与其他7种样品之间存在显著性差异(p<0.05),由数据可以看出Y2的活菌数量又高于Y6的活菌数量,在9种酸奶中活菌数量最高为9.27 log CFU/g;9种酸奶中,Y2和Y6的酸度明显低于其它7种酸奶。酸奶发酵的终止酸度越高,其酸化速度越快,保质期相对缩短,不利于酸奶的长时间储藏,故Y2和Y6的酸度适中,且保质期相对与其它7种酸奶样品更长;从酸奶的pH来看,虽然Y5的pH与其他8种样品酸奶的pH之间存在显著性差异,但由于Y5样品的活菌数量低于Y2和Y6,酸度大于Y2和Y6,而9种酸奶的pH在4～5之间,所以综合考虑Y2和Y6要优于Y5。

表3 酸奶中活菌数量、酸度及pHTable 3 Cells of lactic acid bacteria,acidity and pH of yogurt

注：用Duncan法进行多重比较；同列标有不同字母者表示组间差异显著(p<0.05);标有相同小写字母者表示组间差异不显著(p>0.05)；表4同。

2.2干酪乳杆菌KL1发酵酸奶样品感官评定结果

如表4所示,虽然采用相同发酵菌种,但不同原料乳样品发酵后得到的益生菌酸奶感官评定指标得分不同。其中Y2和Y6酸奶样品感官评定单个指标得分和感官评定总分均明显高于其它几种酸奶,而酸奶的口感指标与组织状态指标相比其它两个评定指标更为重要,9种酸奶样品中口感指标Y2得分最高,通过统计学分析得出Y2与Y6在口感方面与其他几种样品酸奶具有显著性差异(p<0.05)。组织状态指标Y6得分最高,通过统计学分析得Y6与其他8种样品之间存在显著性差异(p<0.05),但是M6是原料乳粉,相比原料乳来说成本高[17],酸奶发酵工艺相比原料乳还要增加复水步骤。

综合干酪乳杆菌KL1发酵酸奶的活菌计数结果、酸度、pH以及感官评定结果,最终选择M2为最佳原料乳样品,同时通过添加M6来弥补其在色泽以及组织状态方面的不足。

表4 酸奶感官评定结果Table 4 Results of sensory evaluation of yogurt

2.3干酪乳杆菌KL1发酵酸奶单因素实验

干酪乳杆菌KL1的接种量对酸奶感官品质的影响如图1所示,在接菌量为2.0%～6.0%之间,随着接菌量的增加,所制酸奶的感官评分越高,但当接菌量为8.0%时,酸奶的感官评分下降,酸奶出现结块现象,同时有大量的乳清析出,进而影响感酸奶官评定的分数,由实验结果得出,接菌量为6.0%时酸奶感官品质最佳。

图1 不同接种量对酸奶感官品质的影响Fig.1 Effect of different inoculation amount on sensory quality of yoghurt

不同葡萄糖添加量对酸奶感官品质的影响结果如图2所示,在葡萄糖添加量为1.5%时,感官评分70分,较其它添加量略高,当葡萄糖的添加量达到2%时,感官评分最低,出现下降的原因是添加2%的葡萄糖所制成的酸奶甜度增大,影响酸奶的口感,由实验结果得出,葡萄糖添加量为1.5%酸奶感官品质最佳。

图2 不同葡萄糖添加量对发酵酸奶感官品质的影响Fig.2 Effect of different glucose content on sensory quality of yoghurt

不同M6添加量对酸奶感官品质的影响结果如图3所示,M6的添加在0.5%～1.5%范围时,可以改善酸奶组织状态和感官品质,但随着奶粉添加量不断的增加,对感官品质也会产生不良的影响,主要表现为所制备的酸奶具有更浓的奶香味,影响了酸奶本身的风味,由实验结果得出,M6添加量为0.5%时酸奶感官品质最佳。

图3 不同M6添加量对发酵酸奶感官品质的影响Fig.3 Effect of different M6 content on sensory quality of yoghurt

2.4干酪乳杆菌KL1发酵酸奶正交实验

干酪乳杆菌KL1发酵酸奶正交实验结果如表5所示,从感官评定指标看,影响程度由强到弱依次为接种量>葡萄糖添加量>M6添加量,最优发酵条件为A3B2C3,即接种量6.0%、M6添加量1.0%、葡萄糖添加量1.5%。菌株KL1发酵酸奶条件中,对活菌数量的影响程度由强到弱依次为接种量>葡萄糖添加量>M6添加量,最优发酵条件为A3B2C1,即接种量6.0%、M6添加量1.0%、葡萄糖添加量0.5%。

表5 干酪乳杆菌KL1发酵酸奶正交实验结果Table 5 Results of Lactobacillus casei KL1 fermented yogurt orthogonal experiment

表6 发酵条件的优化前后比较Table 6 Comparison of fermentation conditions before and after optimization

2.5验证实验

如表6所示,从对照组、感官指标优化组A3B2C3、活菌数量指标优化组(正交实验活菌数量最佳组)A3B2C1以及正交实验感官最佳组A3B3C3比较结果来看,感官指标优化组A3B2C3,即接种量6%、葡萄糖添加量1.5%、M6添加量1.0%条件下进行酸奶发酵,酸奶活菌数量达9.84 log CFU/g,相比对照组高10倍,感官评定总分为96分,这两个指标均高于其它几组;从酸度来看A3B2C3组合条件下制备的酸奶酸度适宜。干酪乳杆菌KL1发酵的酸奶口感细腻、绵滑、黏稠、均匀,香气浓郁。本研究优化后发酵酸奶活菌数量与Gorissen的研究相比,活菌数量和酸奶感官品质与之相当,可以替代进口益生菌功能性酸奶[18-21]。

3 讨论

国内市场酸奶种类繁多,但国内尚无利用改善肠道微环境、抗肿瘤、降血清胆固醇、增强人体免疫力等多种生理功能的益生菌酸奶[18]。藏灵菇源干酪乳杆菌KL1具有高产胞外多糖和胆盐水解酶等活性物质的功能[8],以此菌种作为单一的酸奶发酵菌种发酵生产酸奶,可以填补改善肠道微环境、抗肿瘤、降血清胆固醇、增强人体免疫力等功能性酸奶市场的空白。利用干酪乳杆菌KL1发酵生产的酸奶与普通发酵剂发酵生产的酸奶相比较,虽然在活菌数量以及感官评定方面均达到较高的水平,但该酸奶在贮藏期间产品品质变化以及产品的货架期还需要做进一步的实验研究。

4 结论

原料乳M2为干酪乳杆菌KL1的最佳原料乳样品,同时通过添加乳粉M6来改善在色泽以及组织状态方面的不足。

萄葡糖添加量是影响干酪乳杆菌KL1发酵酸奶感官评定指标和活菌数量指标的最主要因素,接菌量稍次之,而奶粉添加量对感官评定和活菌数量的影响最小,即影响酸奶感官和活菌数量的影响因素顺序为接菌量>葡萄糖添加量>M6添加量。

采用三因素三水平L9(34)正交实验,确定干酪乳杆菌KL1发酵酸奶的优化组合是接种量为6.0%,M6添加量1.0%,葡萄糖量1.5%,在优化条件下进行发酵酸奶,酸奶的活菌数量较对照组高10倍。

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StudyonthefermentationconditionsofprobioticsyogurtwithsingleLactobacilluscaseiKL1

ZHANGMin,ZHANGZi-hao,KANGJian-yi,LIUHui,XIEYuan-hong,YIXin-xin,GAOXiu-zhi*

(Faculty of Food Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing Engineering Laboratory of Probiotics Key Technology Development,Beijing 102206,China)

Based on the single factor and orthogonal experiment,the optimal pure raw milk and fermentation conditionsLactobacilluscaseiKL1 fermented yogurt were determined. The optimized screening of raw milk was M2,at the same time by adding milk powder(M6)to improve color and structure of yogurt. Using three factors and three levels of L9(34),the optimization of fermentation process of yoghurt orthogonal experiment,inoculation amount was the main factor affecting the quality of yoghurt fermentation KL1,the following optimized conditions ofLactobacilluscaseiKL1 fermented yogurt determined that the inoculation rate was 6.0%,the amount of M61.0%,glucose 1.5%,37 ℃ for 22 h,the number of viable bacteria in probiotic yogurt was about 10 times as high as that of the optimized yogurt before the fermentation.

probiotic yogurt;LactobacilluscaseiKL1;orthogonal experiment;sensory evaluation

2017-03-22

张敏(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail: 2317909305@qq.com。

*

高秀芝(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物与生物技术，E-mail:gxz@bua.edu.cn。

2016年北京农学院协同创新建设项目；北京市叶类蔬菜产业创新团队(BAIC07-2017)。

TS252.54

A

1002-0306(2017)21-0104-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.022