一株猪肺炎木糖氧化杆菌分离鉴定及系统进化树分析

蔺旭光，李佳怡，牛天明，娜仁图雅，刘 锴，2

一株猪肺炎木糖氧化杆菌分离鉴定及系统进化树分析

蔺旭光1，李佳怡1，牛天明1，娜仁图雅1，刘 锴1，2

目的鉴定猪群体性肺部感染的病原菌。方法采用生化鉴定、小白鼠致病性试验、16S rRNA PCR鉴定及系统进化树分析。结果根据生化鉴定、小白鼠致病性试验及16S rRNA PCR鉴定。结果表明该菌为一株具有一定毒力的木糖氧化无色杆菌，同源性分析该菌与KF879922.1相似性为99.9%，命名为TLSY-1。结论该菌的鉴定将为仔猪肺炎病原鉴定提供新的依据。

木糖氧化无色杆菌；病原菌；进化树分析；仔猪

木糖氧化无色菌(Achromobacterxylosoxidans)是Alcaligenaceae家族的无色杆菌属的革兰氏阴性能动杆菌，该种属还包括拉氏无色杆菌，皮氏无色杆菌，脱硝无色杆菌，少见无色杆菌和稀有无色杆菌广泛存在于水生环境中，可引起机会性感染，特别容易引起免疫受损的动物发病[1-2]。该菌也可与其他细菌混合感染使动物发病，可引起动物的肺炎、菌血症及化脓性脑膜炎等疾病。该致病菌致死率不高，可因污染的水源、饲料以及患病动物的排泄物感染动物发病。然而木糖氧化无色杆菌在畜牧业的相关报道资料并不多，本研究主要通过微生物诊断该分离菌为木糖氧化无色杆菌。为今后的猪肺炎诊断鉴别提供新的参考。

1 材料与方法

1.1主要试剂 营养琼脂、琼脂粉、氯化钠、葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉(北京澳博星有限责任公司)；质粒提取试剂盒、Jm109感受态、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA纯化试剂盒、Taq酶、MgCl2、dNTPs、RxnBuffer、18T-Vactor载体(TaKaRa有限责任公司)、TAE，EB染色液(纳川)

1.2实验仪器 低温离心机(eppendorf有限责任公司)，生物安全柜、恒温培养箱、PCR仪、恒温摇床(Thermo有限责任公司)、电泳仪、凝胶成像系统(Bio-Rad有限责任公司)。

1.3实验动物 体重20～25 g健康小白鼠40只，由内蒙古民族大学动物实验室提供。

1.4 实验方法

1.4.1病料采集及观察 对通辽某猪场患病猪观察发病症状并记录，病亡后30 min内采集心、肝、脾、肺、肾、十二指肠及淋巴结等脏器，记录各脏器的病理变化。各脏器触片革兰氏染色后镜检并记录。

1.4.2致病菌的分离与纯化 取心、肝、脾、肺、肾、十二指肠及淋巴结在无菌操作下分别接种在10%血液琼脂培养基上，于厌氧缸内37 ℃培养24 h，观察细菌菌落形态，挑取单个菌落接种于LB液体培养基，置于恒温摇床上37 ℃ 24 h纯培养。取培养物涂片染色镜检。

1.4.3生化试验 挑取血液琼脂培养基上生长良好的单个菌落，接种于微量发酵管中，37 ℃培养16 h后观察结果。

1.4.4动物致病性实验 将已纯化的菌种在LB培养基中37 ℃培养24 h，细菌计数，用LB培养基将菌液稀释至1.0×109/mL。纯化的菌液腹腔注射20只小鼠，每只小鼠注射0.5 mL。另选20只注射生理盐水作对照组，24 h内每5 h观察一次结果。

1.4.516S rRNA的PCR鉴定 取菌液参考DNA提取试剂盒，提取菌液DNA，冷冻保存备用，使用时取出，PCR引物根据参考文献[3-6]由大连宝生物合成。

表1 PCR引物序列
Tab.1 Primer sequence

引物序列Primersequence5′—3′扩增目的片段大小/bpTargetfragment27FAGAGTTTGATCCTG⁃GCTCAG13691429RGGTTACCTTGT⁃TACGACTT

反应体系试剂MgCl22 μL,Rxn Buffer2 μL,上引物1 μL下引物1 μLTaq酶1 μL模板2 μ,dd H2O补齐至25 μL,反应条件为：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s 退火55 ℃ 30 s 延伸72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。反应后将取PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶下电泳90V、30 min，EB染色观察结果。将目的片段使用DNA纯化试剂盒纯化回收，用18T-Vactor T载体16 ℃反应过夜，转化至感受态JM109中，均匀涂布于X-Gal选择培养基(含Amp、IPTG及X-Gal)37 ℃培养16 h。挑取阳性菌落接种于含有Amp的LB培养基37 ℃培养过夜用质粒提取试剂盒提质粒，经鉴定正确后送至长春某测序公司测序。

1.4.6同源性及进化树分析 将测序结果在GeneBank进行Blast。选取同源性相近的几条序列，用DANMAN V6软件对选取的序列进行编辑，并构建系统进化树分析结果。

2 结 果

2.1病料及致病菌形态学观察 患病猪外观可见皮毛发暗，病猪精神沉郁，食欲减退，不喜运动，躺卧。鼻口有淡绿色黏液样物质流出，呼吸困难，伴有轻微咳嗽，流涎，听诊肺部有湿罗音。体温升高，眼结膜潮红。剖检可见胸腔有脓性积液，肺部有肉样病变，触之有捻发音。会厌软骨有溃疡点，气管有出血点并有白色泡沫样液体，心包积液较为严重，心脏内壁有针尖状出血点，脾脏边缘有梗死及出血点。十二指肠黏膜有出血，肠壁较厚。腹股沟淋巴结、下颌淋巴结以及大网膜淋巴结有肿大。

在内脏触片染色镜检可见有革兰氏阴性短杆菌，散落存在，偶见成对出现。在血液琼脂培养基上生长成灰白色菌落，表面湿润光滑且边缘整齐。

2.2生化试验结果 氧化酶(+)触酶(+)枸橼酸盐(+)乙酰胺酶(+)麦芽糖(-)甘露醇(-)DNA酶(-)蔗糖(-)尿素酶(-)

2.3动物致病性试验 实验组20只小鼠在24 h内死亡12只，而对照组正常.死亡小鼠心和肝脏触片革兰氏染色镜检，可见革兰氏阴性短杆菌，与患病猪内脏触片的观察结果相似。

2.416S rRNA PCR鉴定结果 PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳后，将凝胶在凝胶分析系统下观察结果，在1 000～2 000 bp处有一条清晰带，与预期的大小相一致。经测序后PCR产物大小为1 389 bp。

测序结果在NCBI上进行同源性比对，结果与木糖氧化无色杆菌同源性达99%(序列号gb|KF879922.1)，该结果充分证明病死猪的致病菌为木糖氧化无色杆菌。

图1 会厌软骨溃疡点 图2 猪肺脏病变 图3 分离细菌镜检照片(400×)Fig.1 Epiglottis ulcer point Fig.2 Porcine lung disease Fig.3 Isolate bacterial microscopic photographs

1：目的带；2：DNA Marker DL 2 0001: Purpose band; 2: DNA Marker DL 2000图4 木糖氧化无色杆菌16S rRNA PCR扩增电泳结果Fig.4 16S rRNA PCR result of Achromobacter xylosoxidans

图5 木糖氧化无色杆菌系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of Achromobacter xylosoxidans

2.5木糖氧化无色杆菌系统进化树同源性分析 经16S rRNA鉴定的菌株在NCBI同源性比对后，与木糖氧化无色杆菌的同源性达99%。选取序列相近的序列经过系统进化树的分析，测序序列与线虫体内分离的木糖氧化无色杆菌的同源性达99.9%，与牛体内分离的菌种同源性达99.8%。并且与自然界中泥沙、水源、植物等有很高的同源性，均能达到99%以上。且所有选取构建系统进化树的序列综合一致性达91.76%。

3 讨 论

本试验从病死猪肺脏内分离出疑似仔猪感染发病致病菌，通过形态学观察、细菌的分离培养及纯化、生化试验、动物致病性试验、16S rRNA的分子生物学试验以及系统进化树分析等一系列鉴定方法，证明从患病死猪体内分离出的致病菌为木糖氧化无色杆菌。

木糖氧化无色杆菌，原名产碱杆菌木糖氧化无色杆菌，是一种有氧，非发酵，革兰阴性杆菌具有低毒力[7]。它最早于1971年被 Yabuuchi 和Ohyama在一位慢性炎症中耳炎患者的体内发现[8]。木糖氧化无色杆菌属于机会致病菌，并可存在于多种临床标本，如耳分泌物、血液、尿液等，可引起菌血症，败血症，呼吸系统感染等[9]。木糖氧化无色杆菌引起动物患病的病例并不多，畜牧业的相关资料甚少，但在畜牧业的日常预防中也不能忽视，需要相关工作人员引起重视。当动物感染该菌发病时主要以肺炎症状为特异性临床表现，有呼吸困难、流涎、体温升高等症状。剖检可见肺部病理变化明显，有间质性肺炎、败菌症。发病时可分离致病菌后做药敏来选择有针对性治疗的抗生素。木糖氧化无色杆菌的耐药性较强，能对多种抗生素产生耐药性[10]。木糖氧化无色杆菌有β酰胺酶的耐药基因以及金属酶能对β酰胺酶类药物产生耐药性[11]。

分离鉴定的木糖氧化无色杆菌菌株在进化树的分析下，可见该菌株与线虫体内的木糖氧化无色杆菌相似度最高，其次与气孔材料以及环境中的泥土、豆科植物根瘤有较高的相似度。可推断猪场的患病猪与被线虫感染有关，线虫是猪群较为常见的有危害的寄生虫之一。线虫严重危害人类和动物的健康，尤其当人体免疫水平下降时，线虫大量繁殖，向全身各器官扩散，引起人的重度感染，甚至造成人的死亡[12]。因感染猪发病的致病菌与线虫中的木糖氧化无色杆菌有很高的相似度，感染猪发病的致病菌是否是由线虫体内感染的木糖氧化无色杆菌感染，还需要进一步去验证。也可能猪舍的环境中的地面或建材被木糖氧化无色杆菌污染后，感染健康猪群发病。在平时预防时，需要保持圈舍的通风性良好，时常对圈舍打扫卫生以及做好消毒以及驱虫工作，可每周一次用新吉尔灭或1%高锰酸钾对猪舍进行消毒并定期给猪驱虫。如发现有发病猪需要及时的隔离以及进行治疗，并对患病猪用过的饮水器食槽等进行严格的消毒防治病原菌扩散传播。因目前市场上并没有相应的特异性疫苗，所以也可注射木糖氧化无色杆菌的灭活苗来进行免疫，在生产中能有良好的免疫保护效果。

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IdentificationandphylogeneticanalysisforAchromobacterxyloseOxidasinporcinepneumonia

LIN Xu-guang1, LI Jia-yi1, NIU Tian-ming1,NA Ren-tu-ya1, LIU Kai1,2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,InnerMongoliaUniversityforNationalities,Tongliao028000,China;2.InnerMongoliaBeef&CattleDiseaseControlCenter,Tongliao028000,China)

To identify the pathogen of an outbreak of pneumouia in pig-farm, we used biochemical identification, pathogenicity test in mice, PCR identification by 16S rRNA, and phylogenetic tree analysis for the identification. Results showed that the pathogen was anAchromobacterxylosoxidanswith certain virulence and named TLSY-1. This TLSY-1 was the most similar to KF879922.1, and affinity rate were 99.9% by homology analysis. This result identified that TLSY-1 is a new pneumonia pathogens in piglets.

Achromobacterxylosoxidans; pathogen; phylogenetic analysis; piglets

Liu Kai，Email: liukai721023@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.011

内蒙古科技厅项目(No.2016MS0310)资助

刘 锴，Email：liukai721023@163.com

1.内蒙古民族大学动物科技学院，通辽 028000；

2.内蒙古自治区肉牛疾病预防控制中心，通辽 028000

R378

A

1002-2694(2017)10-0908-04

Supported by the Inner Mongolia Science and Technology Department Program(No.2016MS0310)

2016-12-09编辑张智芳