鸡原代肝细胞培养及叶酸对脂质代谢相关基因表达的影响

刘艳利，党燕娜，段玉兰，杨小军



鸡原代肝细胞培养及叶酸对脂质代谢相关基因表达的影响

刘艳利，党燕娜，段玉兰，杨小军

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）

腹脂沉积是目前家禽养殖过程中的一个普遍现象。与哺乳动物不同，家禽的脂质代谢主要发生在肝脏，前人很多研究发现叶酸和IGF2均参与调控动物的脂质代谢，因此，试验旨在建立鸡原代肝细胞培养条件，并研究叶酸对鸡原代肝细胞脂质代谢相关基因表达的影响，为体外探究叶酸调控家禽脂质代谢机制提供依据。采用胶原酶消化配合鸡淋巴细胞分离液纯化法分离得到鸡原代肝细胞，用高碘酸希夫氏染色方法进行肝细胞鉴定；同时分离得到的肝细胞用正常培养基培养36 h后，更换含不同叶酸浓度的培养基（0，1，5，10，15，和20 mg·L-1），每个叶酸浓度6个重复，处理12 h后收集上清液，并收集细胞提取总RNA，用RT-qPCR法检测基因相对表达量，MTT法检测细胞增殖，商业试剂盒方法检测上清液中LDH含量。并分析基因表达之间的相关性以及叶酸剂量与基因表达之间的回归关系。采用胶原酶消化配合鸡淋巴细胞分离液纯化法可以获得分离效果好且纯度高的鸡肝细胞；不同剂量的叶酸没有影响肝细胞培养液中的LDH活性（＞0.05），也没有对肝细胞的增殖产生影响（＞0.05）；与1 mg·L-1剂量的叶酸对照组相比，10、15和20 mg·L-1的叶酸显著降低了肝细胞IGF2以及与脂质合成代谢有关的ACC和FAS基因的表达（＜0.05），但叶酸并没有对鸡肝细胞中与脂质分解代谢有关的CPT1和PPARα基因的表达产生影响（＞0.05）；并且鸡肝细胞中ACC和FAS基因的表达与IGF2存在一定的正相关（＜0.05）；除此之外，鸡肝细胞IGF2，FAS和ACC的表达与叶酸剂量也存在着线性和二次曲线的回归关系（＜0.05）。叶酸的添加可降低鸡原代肝细胞中与脂肪酸合成相关基因的表达，并且FAS和ACC基因的表达可能与IGF2具有正相关关系；本试验中叶酸的最适剂量为15 mg·L-1。

叶酸；IGF2；肝细胞；脂质代谢；鸡

0 引言

【研究意义】在目前的家禽养殖过程中，畜牧工作者长期偏重生产性能选育的同时也出现了体脂沉积过度等问题，其不仅影响家禽的肉、蛋产量和品质，由其引发的腹水症等代谢疾病也会给养禽业带来巨大的经济损失。与哺乳动物不同，鸡体内90%—95%的脂肪合成主要发生在肝脏器官[1]，故而，体外研究家禽的脂质代谢应该首选原代肝细胞模型。家禽的脂质沉积除了受遗传和环境等因素的影响外，营养水平也对其起重要作用，近些年来，关于通过营养素途径来调控家禽脂质代谢的报道越来越多[2-4]，因此，体外建立鸡原代肝细胞培养体系，对探究营养素调控家禽脂质代谢的分子机制具有重要意义。【前人研究进展】有研究表明，日粮叶酸的添加可以降低猪血清中胆固醇[5]和甘油三脂[6]的含量；母鼠饲喂含5 mg·kg-1叶酸的日粮可显著降低小鼠血清甘油三脂浓度[7]。日粮单独添加1.5 mg·kg-1叶酸或者混合添加烟酸60 mg·kg-1与叶酸1.5 mg·kg-1均显著降低了肉鸡的腹脂率[8]；喻小琼的研究指出种鸡日粮高的叶酸添加量能降低后代出壳时脂肪酸合成基因的表达[3]。除此之外，有研究报道给妊娠期和哺乳期的小鼠饲喂高脂日粮能够提高子代肝脏IGF2、PPARα和CPT1的表达，指出IGF2可能参与调控脂质代谢[9]。【本研究切入点】家禽腹脂率高的问题会给养殖业带来一定的损失，SPENCER等[10]研究表明鸡被植入人重组IGF2后能显著提高腹脂率；并且IGF2基因也被研究表明与鸡脂肪性状有关，可作为候选基因去选育低腹脂鸡品系[11]，因此IGF2基因在家禽中与脂质代谢有关。家禽养殖中本研究团队前期研究指出叶酸能改变鸡脾脏和胸腺IGF2的表达[12]。但叶酸和IGF2在家禽的脂质代谢中究竟如何发挥调控作用？它们之间又存在怎样的内在联系？很少有关于这方面的报道。【拟解决的关键问题】叶酸作为营养素在机体内的代谢较为复杂，无法直接进行机制探究，故本试验通过建立体外培养鸡原代肝细胞模型，探究叶酸对鸡原代肝细胞脂质代谢相关基因表达的影响，为体外探究叶酸调控家禽脂质代谢机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

1日龄刚出壳的健康公鸡，购自陕西杨凌巨隆禽业有限公司。

1.2 主要试剂和仪器

叶酸、MTT和胶原酶IV购自Sigma公司；Trizol、RNA反转录试剂盒和SYBR试剂盒购自TaKaRa公司；RPMI 1640正常培养基、无叶酸培养基以及青链霉素（双抗）购自Gibco公司；胎牛血清购自南美BIOWEST公司；乳酸脱氢酶（LDH）和高碘酸希夫氏染色（PAS）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，鸡淋巴细胞分离液和DMSO购自索莱宝公司。

核酸定量分析仪（Nanodrop ND-1000）；实时荧光定量PCR仪（iQ5），购自Bio-Rad 公司；多功能酶标仪（基因有限公司）；细胞培养六孔板（美国康宁公司）；离心机（Eppendorf）；CO2培养箱；摇床；倒置显微镜。

1.3 肝细胞分离

试验鸡处死后置于75%酒精中消毒15 min后转至无菌超净台，打开腹腔取出肝脏浸到含有5×双抗的PBS中进行清洗；随后用眼科剪子将肝脏剪成小碎块，并用PBS低速离心清洗4遍；将干净的组织碎块转至PBS配制的消化液中（含0.5 g·L-1的胶原酶IV和0.6 g·L-1的CaCl2）37℃恒温摇床消化50 min；细胞悬液分别经100目和200目细胞筛过滤后，先50×g低速离心去除部分非实质性肝细胞，然后用含1×双抗的PBS 120 ×g离心清洗细胞3遍；将细胞制成悬液之后轻轻加至鸡淋巴细胞分离液之上，250×g离心20min去除血细胞和非实质性肝细胞，抽取分离液与细胞悬液界面的雾状肝细胞悬液并用PBS清洗2遍，用培养基重悬细胞，计算细胞浓度后，按106·mL-1细胞密度接种到六孔板中，进行试验，按5×105·mL-1接种到培养皿进行后续染色形态学观察。消化体系中钙离子浓度、胶原酶类型及浓度确定参考陈黎龙和刘腾飞的方法[13-14]，低速离心及淋巴细胞分离液去除血细胞和非实质性肝细胞参考江青艳和Puviani的试验方法[15-16]。

1.4 肝细胞培养及试验处理

细胞在12 h过夜贴壁后换液，培养36 h后细胞长势稳定并出现融合交汇基本铺满板壁80%左右时，开始换处理培养基，处理培养基分别含0、1（正常对照培养基）、5、10、15和20 mg·L-1叶酸，每个叶酸浓度下6个重复。在处理12 h后，收集上清液，用PBS清洗细胞2遍后加Trizol，裂解5 min后用移液枪吹打收集裂解液，转至﹣80℃保存。

1.5 RT-PCR检测基因 mRNA相对表达水平

细胞RNA的提取以及RNA反转录合成cDNA的过程均参照试剂盒说明书进行。荧光定量试验使用TaKaRa 公司的SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒，选用β-actin作内参基因。基因引物序列见表1。RT-PCR的反应程序为：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸 30 s，40个循环。采用2-△△Ct法计算基因相对表达量[17]。

1.6 细胞上清液LDH活性与细胞PAS染色

细胞上清液中乳酸脱氢酶的酶活及细胞PAS染色进行形态学观察的步骤均参照试剂盒说明书进行操作。

表1 基因引物序列

1.7 MTT法检测细胞增殖

细胞的培养处理方法同1.4，参照前人研究方法[18]，在96孔板上每个叶酸浓度设置10个重复，在处理结束前4 h，每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1），轻轻拍打培养板四周使其均匀，处理结束后，去除培养液，每孔加入180 μL DMSO，摇床摇10 min，用酶标仪检测各孔的吸光度。

1.8 数据统计分析

数据分析利用SPSS 20.0统计软件，采用One-way ANOVA进行单因素方差分析，并用Duncan法进行多重比较，显著性判断标准均设置为＜0.05。

2 结果

2.1 肝细胞染色及形态学观察

如图1所示，细胞培养24 h时，肝细胞呈典型上皮细胞样的多角形，外周有锯齿状伪足向外伸展，呈集落状生长；48 h时，肝细胞集落之间相互接触出现连接汇合，呈现岛屿状生长状态；72 h时，岛屿状间连接融合成片，细胞排列紧密；96 h时，细胞生长状态仍维持良好，并且基本铺满整个培养皿底。PAS染色是一种糖原染色方法，能将肝细胞胞质中的肝糖原颗粒染成红色，从对分离的鸡原代肝细胞PAS染色可以看出，所分离的肝细胞纯度较高，可用于后续试验。

2.2 叶酸对肝细胞上清液中LDH活性的影响

叶酸对细胞上清液中LDH活性的影响见图2，由图可知，各个处理组LDH活性无显著差异（＞0.05），LDH是由胞浆释放到培养液中的，表明本试验中的叶酸剂量并没有对肝细胞产生损伤。

2.3 叶酸对肝细胞增殖的影响

叶酸对鸡肝细胞增殖的影响见图3，本试验中不同剂量的叶酸对鸡原代肝细胞的增殖并没有产生影响（＞0.05）。

2.4 叶酸对肝细胞脂质代谢相关基因表达的影响

叶酸对肝细胞脂质代谢相关基因表达的影响如表2所示，与正常培养基对照组（含叶酸1 mg·L-1）相比，10、15和20 mg·L-1的叶酸显著降低了鸡肝细胞IGF2的表达（＜0.05），但0和5 mg·L-1的叶酸并没有对IGF2基因的表达产生影响（＞0.05）。不同剂量叶酸对脂质分解代谢相关的肉碱酯酰转移酶1（CPT-1）和过氧化物酶体增殖物活化受体α（PPARα）基因的表达没有影响（＞0.05）；但与对照组相比，10、15和20 mg·L-1的叶酸显著降低了脂肪酸合成酶（FAS）和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的表达（＜0.05）；同样，0和5 mg·L-1的叶酸并没有对FAS和ACC的mRNA表达产生影响（＞0.05）。

图1 不同培养时间的肝细胞PAS染色及形态

图2 叶酸对肝细胞培养液中LDH活性的影响

图3 叶酸对鸡肝细胞增殖的影响

表2 叶酸对肝细胞脂质代谢相关基因表达的影响

2.5 FAS和ACC基因表达与IGF2表达的相关性分析

不同剂量叶酸处理下鸡原代肝细胞IGF2表达与脂质合成代谢相关的FAS和ACC基因表达的相关性分析见图4，FAS和ACC的表达与肝细胞IGF2的表达呈一定的正相关（＜0.05），值分别为0.685和0.808。

2.6 叶酸与脂质代谢相关基因表达的回归分析

由表3可知，肝细胞基因的表达与叶酸的处理剂量存在着线性和二次曲线回归关系（＜0.05），再结合表2中的基因表达分析，可以得出，在本试验中叶酸的最佳处理剂量为15 mg·L-1。

图4 鸡肝细胞FAS和ACC表达与IGF2表达的相关性分析

表3 叶酸剂量与基因表达的回归分析

3 讨论

肝细胞的分离主要包括经典的原位灌注法[19]和酶消化法[20]，而前者需要专门的灌注设备，试验所用酶量大、消费较高，也易污染[4]，故本试验选择酶消化法进行肝细胞的分离，并且为保证肝细胞不受动物采食日粮的影响，选择1日龄刚出壳小鸡作为试验动物。肝细胞主要有肝实质细胞、非肝实质细胞和细胞内间隙组成[21]，本试验结合前人的差速离心[22]和密度梯度离心方法[21]，用鸡淋巴细胞分离液纯化肝细胞。PAS肝糖原染色结果显示细胞形态与前人描述的肝细胞形态一致[14, 16]，染色后细胞呈红色反应，证明分离得到的是肝实质细胞，与蒋志惠的结果一致[23]。

LDH是存在于活细胞内的胞内酶，当细胞受到损伤后，才会通过细胞膜被释放到细胞培养液中，因此，细胞培养液中的LDH活性在一定程度上反应了细胞的损伤情况[24]。刘腾飞等[14]通过检测培养液中LDH活性指出分离的原代肝细胞在培养24 h后就可以适应体外的新环境并对在原代分离过程中损伤的细胞进行自我修复，因此本试验选择在细胞离体分离培养36 h，细胞融合并铺满80%左右开始添加处理。并且在处理结束后，各组培养液中的LDH活性并无显著差异，说明本试验中所添加的叶酸剂量并没有对肝细胞产生损伤，并且MTT细胞增殖试验也验证了这一结果。

有研究指出IGF2过表达的转基因小鼠其脂肪量显著降低[25]，通过基因敲除使IGF2低表达的成年鼠往往也伴随脂肪沉积的增加和肥胖的发生[26]，这些结果都显示IGF2在哺乳动物中可能与脂肪的沉积是呈负相关的。但是，在家禽上的研究却与此相反，人重组IGF2植入在鸡体内后显著增加了腹脂的沉积[10]，这种矛盾可能与不同动物机体脂质代谢的差异有关，毕竟家禽的脂质代谢多集中在肝脏而哺乳动物多是在脂肪组织。

本试验的结果显示叶酸的添加可降低肝细胞IGF2的表达，WANG等[27]的文中也提到IGF2与鸡的脂质合成有关。鸡肝细胞中与脂质代谢相关的基因表达结果也表明叶酸虽没有影响脂质分解代谢相关基因的表达，但10、15、和20 mg·L-1的叶酸显著降低了ACC和FAS的表达，此结果与喻小琼[28]的研究类似，其试验表明种鸡日粮添加5 mg·kg-1的叶酸能显著降低仔鸡1日龄肝脏FAS的表达和仔鸡16胚龄肝脏ACC的表达。并且叶酸的添加也能显著降低鸡脂肪细胞中FAS的表达[29]。ACC和FAS均是所参与反应的限速酶，控制脂肪酸的从头合成，对肝细胞中FAS和ACC基因表达与IGF2进行相关性分析结果显示它们之前具有正相关关系，因此印证了WANG等[27]的观点，表明在家禽的脂质代谢中，IGF2可能与脂肪酸的合成具有正相关关系，但IGF2与FAS和ACC之间的具体联系途径，以及叶酸参与调控这些基因表达的机制，还有待进一步研究。

4 结论

叶酸的添加可降低鸡原代肝细胞中与脂肪酸合成相关基因的表达，并且FAS和ACC基因的表达可能与IGF2具有正相关关系；本试验中叶酸的最适剂量为15 mg·L-1。

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（责任编辑 林鉴非）

Effect of Folic Acid on Lipid Metabolism Associated Gene Expression in Primarily Cultured Chickens Hepatocytes

LIU Yanli, DANG Yanna, DUAN Yulan, YANG Xiaojun

(College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi)

Abdominal fat deposition is a universal phenomenon at present in poultry industry. Different from mammals, 90%-95% of lipid metabolism in poultry occurs in the liver. Previous studies have demonstrated folic acid and IGF2 were involved in animals lipid metabolism. The study was conducted to establish the method for primary culture of chicken hepatocytes and investigate the effects of folic acid on IGF2 and genes expression associated with lipid metabolism in primary chicken hepatocytes, further providing a basis for exploring lipid metabolism of poultry.Chicken hepatocytes were isolated by collagenase digestion combined with purification of chicken lymphocyte separation fluid, and evaluated by PAS staining,respectively. After 36 h culture of hepatocytes, cells were treated with different concentration of folic acid for 12 h. Hepatocytes proliferation and injury was detected by MTT method and LDH activity in culture medium respectively. Cells were collected to get total RNA for gene expression analysis by RT-PCR. Later, correlation analysis was carried out between IGF2 and lipid metabolism related genes expression. Regression analysis was performed between folic acid concentration and genes expression.The results showed that hepatocytes were isolated with high purity. Folic acid didn’t affect cell proliferation and cellular LDH activity (＞0.05).When compared with the control group (1 mg·L-1folic acid), 10, 15 and 20 mg·L-1folic acid significantly reduced IGF2 expression in chicken hepatocytes (＜0.05), and same phenomenon was observed in FAS and ACC expression. However, folic acid had no effects on CPT-1 and PPARα expression(＞0.05) . In addition, FAS and ACC expression had positive correlation with IGF2 mRNA level in chicken hepatocytes (＜0.05). There existed linear and quadratic regression between genes expression and folic acid concentration (＜0.05).In conclusion, folic acid could reduce gene expression associated with fatty acid synthesis in chicken hepatocytes. In addition, FAS and ACC mRNA level might have positive connection with IGF2 expression. Optimum treatment dose of folic acid was 15 mg·L-1in this study.

folic acid; IGF2; hepatocytes; lipid metabolism; chicken

2016-09-01；接受日期：2017-09-14

国家重点研发计划（20170502200，2017YFD0500500）、陕西省科技统筹创新工程计划项目（2017TSCXL-NY-04-04，2015KTCQ02-19）

刘艳利，Tel：18700807384；E-mail：1085752204@qq.com。通信作者杨小军，E-mail：yangxj@ nwsuaf.edu.cn