长期夜班工作医护人员肠道菌群结构的变化

罗科学　王钦贤　陈富兴

[摘要] 目的 调查长期夜班工作医务人员肠道菌群结构的变化，探讨肠道菌群与长期夜班工作所致慢性疾病的关系。方法 采集30例有5年以上夜班工作经历的医务人员（试验组）及30例非夜班工作的健康志愿者（健康对照组）的粪便，利用荧光定量PCR方法定量分析两组人群肠道主要菌群结构的变化。 结果 试验组与健康对照组相比，长期夜班工作的医护人员的拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌含量均有下降，差异有高度统计学意义（P<0.01）。而肠球菌和肠杆菌则较健康对照组有所升高，其中肠球菌组间比较，差异有高度统计学意义（P<0.01），肠杆菌组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 长期夜班工作医务人员肠道内益生菌拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌减少，条件致病菌肠球菌和肠杆菌增多，存在较明显的肠道菌群结构失调。

[关键词] 长期夜班工作医务人员；肠道菌群；荧光定量PCR；调查

[中图分类号] R378 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）28-0126-04

[Abstract] Objective To investigate the changes of intestinal flora structure in medical staff taking long-term night shift， and to explore the relationship between intestinal flora and chronic diseases caused by long-term night work. Methods Faeces of 30 cases of medical personnel with more than 5 years working experience of night work（experimental group） and 30 healthy volunteers who had no night work（healthy control group） were collected. Fluorescence quantitative PCR method was used to quantitatively analyze the changes of main intestinal flora structure in the two groups. Results Compared with the healthy control group， the contents of Bacteroides， Bifidobacterium and Lactobacillus in the medical staff taking long-term night shift were all decreased in the experimental group. There were statistically significant differences between the two groups（P<0.01）. The contents of Enterococcus and Enterobacteriaceae were higher than those in the healthy control group， and there was significant difference in Enterococcus between two groups（P<0.01）. The difference in Enterobacteriaceae was significant between two groups（P<0.05）. Conclusion The contents of intestinal probiotics such as Bacteroides， Bifidobacterium and Lactobacillus are decreased in the medical staff taking long-term night shift， while the conditioned pathogens such as Enterococcus and Enterobacteria are increased. There are more significant intestinal flora structural disorders.

[Key words] Medical staff taking long-term night shift； Intestinal microflora； Fluorescence quantitative PCR； Investigation

医务工作者工作繁忙，工作节奏快，职业压力大，会影响到本身的心身健康。尤其是长期夜班工作的医护人员，长期的睡眠-觉醒周期不规律，缺乏运动，饮食不规律，以及经常面对夜班突发应激事件，不但会引起职业倦怠，导致亚健康状态，使医疗工作效率下降，甚至会出现医疗差错。而且也会导致疲劳综合征、肥胖、高血压、慢性胃炎、抑郁症等疾病[1]。

肠道菌群参与人体的消化、营养物质的吸收、能量的供应、脂肪代谢、免疫调节等诸多环节，不管是在健康状态还是在疾病状态下的人体代谢过程均会受肠道菌群的影响[2-3]。长期夜班工作有可能会导致肠道菌群的变化，而这种变化可能是导致亚健康状态和相关慢性疾病产生的关键因素。因此，研究夜班工作医务人员肠道菌群的变化，不但对相关慢性疾病有预防意义，同时可以进一步针对肠道菌群为靶点进行治疗。然而专门针对医护人员肠道菌群变化的研究较少，单纯细菌培养方法有很大局限性，已有研究显示肠道菌群结构失调是在“种属”的水平发生的，因此，必须用不同种属的细菌比例研究肠道菌群结构变化[4]。本文利用荧光定量PCR方法通过研究5年以上夜班工作经历医务人员的肠道菌群变化，比较其与健康人群腸道菌群的差异。endprint

1 资料与方法

1.1一般资料

选取我院工作的医护工作者，纳入及排除标准：①年龄20～50岁之间；②1周内需轮值夜班1次，连续5年以上；③排除既往有心脏病、肝脏、肾脏等重要器官以及内分泌系统疾病者；④排除消化系统疾病病史，未进行过胃肠道手术，1个月内无急性腹泻症状的急性肠传染病；⑤前3个月内未使用各种抗生素，1个月内未服用肠道益生菌、质子泵抑制剂、胶体铋剂。最终入选30例为试验组。并随机选取没有轮值夜班的符合上述①、③、④、⑤条件的健康志愿者30例为健康对照组。其中试验组平均年龄（36.0±5.2）岁，健康对照组平均年龄（36.0±7.2）岁，男女比例均为1∶1，两组年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 标本的收集 采集试验组和健康对照组成员粪便样品，样品均用无菌容器收集，置于干冰上，30 min内送至实验室，-80℃冻存。

1.2.2 粪便DNA提取 ①标本于常温下融冻，取0.2 g大便，加1 mL磷酸盐缓冲液（PBS），0.05 mol/L，pH7.4，充分混匀5 min；②1000 rpm离心10 min，取上清液，按上述方法重复3次；③收集全部上清液14000 rpm离心10 min后，弃上清留取沉渣；④加1 mL PBS混匀沉渣，14000 r/min离心15 s，弃上清；反复用PBS洗涤4次。⑤DNA的纯化：将上述菌体液14000 r/min离心15 s后，取200 μL上清，为分离出的细菌。⑥取200 μL DNA提取A液于0.5 mL离心管中，每管分别加入待检细菌液50 μL，颠倒数次充分混匀，室温静置3 min。⑦加入250 μL DNA提取B液，颠倒数次充分混匀。⑧13000 rpm离心10 min，取上清。⑨加入200 μL DNA提取C液，颠倒数次混匀。⑩13000 rpm离心5 min，吸弃上清，室温或55℃放置2～5 min晾干。加入20 μL样品稀释液混悬沉淀物，短暂离心使液体落于管底，取上清行PCR。

1.2.3 引物的设计合成 PCR特异扩增引物片段长度和序列见表1。

1.2.4 荧光定量PCR ①阳性标准品及其梯度的制备：（标准曲线定量法）；②阳性标准品的制备：预实验PCR扩增的阳性产物经过2%低熔点琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙胺啶，用TAE缓冲液配制），在长波紫外灯下，割下目的条带。用回收试剂盒（QIA quick CEL Extraction KIT）回收纯化，克隆。提取阳性克隆质粒，即为阳性标准品。③阳性标品梯度的制备：取阳性标准品50 μL按10倍稀释（加水45 μL并充分混匀），依次稀释下去，制备成阳性定量标准品梯度，倍比稀释一定要准确，否则影响定量结果。每次上机必须新鲜配置阳性定量标准品梯度，正式上机时以包含所有样本的4个梯度上机即可。④反应体系及反应条件。采用iQTMSYBR Green supermix（Bio-Rad，USA）配置定量PCR反应体系，25 μL总体积含2×Supermix 12.5 μL和上下游引物（12.5 μmol）各1 μL。⑤待测样本Ct值均落在标准曲线上，通过各Ct值在标准曲线上所对应的拷贝数得到待测样本拷贝数。因按照试剂盒提取说明0.2 g粪便组织共提取200 μL基因组，检测前待测样本按不同倍数稀释到同一浓度，最后结果需乘以总稀释倍数，计算出每克粪便的细菌拷贝数，单位换算成1 g copies/g湿便，进行统计学分析。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用（x±s）表示，非正态分布参数经自然对数转换后进行统计分析，多重组间比较采用单因素方差分析方法，组间两两比较采用q检验，组内治疗前后比较采用配对设计t检验，数据相关分析采用Pearson直线相關性分析，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

实时荧光定量PCR结果显示，试验组与健康对照组比较，长期夜班工作的医护人员的拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌含量均有下降，三者组间比较差异有高度统计学意义（P<0.01）。而肠球菌和肠杆菌则较健康对照组有所升高，其中肠球菌组间比较，差异有高度统计学意义（P<0.01），肠杆菌组间比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

3 讨论

本研究发现长期夜班工作医务人员的肠道菌群结构与健康对照组相比发生了明显的变化，其中拟杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌含量均有下降；而肠球菌和肠杆菌则比健康对照组数量有增高。

拟杆菌是肠道中最主要的厌氧菌。有研究发现，其在帮助宿主分解多糖、促进肠黏膜的血管再生和免疫系统的发育方面有重要作用，有利于维持肠道微生态的平衡[5]；研究发现拟杆菌属中有多种细菌对肠黏膜抵抗力有益[6]。拟杆菌门/厚壁菌门这一比值与血糖浓度和肥胖呈正相关[7-8]。

双歧杆菌能够粘附于肠上皮细胞表面，可以防止病原菌或条件致病菌的定植[9]；作为免疫原可诱导增强机体的各种免疫功能，从而增强机体免疫功能[10]；可使胆固醇转化为人体无法吸收的粪甾醇，随粪便排出体外，因而可以起到降血酯作用[11]；有研究者通过对高脂膳食喂养的小鼠饲喂寡果糖益生元来改善肠道内双歧杆菌的含量，发现双歧杆菌可以改善糖耐量、降低内毒素血症、减少细菌移位，使低浓度炎症好转[12-13]。

乳酸杆菌可促进肠道黏蛋白分泌，抑制大肠杆菌、产气荚膜梭菌等有害菌对黏液、肠上皮细胞的粘附，对维护、稳定肠黏液层屏障功能有重要作用[14]。可抑制有害菌的繁殖，对胃肠道的感染具有预防与治疗作用[15]；能激活机体的免疫系统，特别是巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK）细胞和B淋巴细胞；乳酸菌还具有降低血清胆固醇等作用[16]。上述三种细菌是有益菌，能够帮助消化、维持肠道屏障、降血脂、增强免疫功能等，其数量在长期夜班工作医务人员的肠道较健康人下降，说明长时间频繁的夜班工作已经使肠道菌群结构发生了变化，使机体更容易出现肠功能紊乱、高血脂、免疫异常等疾病。endprint

本研究发现长期夜班工作医务人员肠球菌和肠杆菌较健康对照组有所升高。肠杆菌和肠球菌是人体内常驻菌群，正常生理状态下不引起疾病，但在一定条件下可导致感染。有研究显示，肠杆菌细胞壁可产生LPS，导致脂多糖LPS释放增加，当肠道黏膜屏障功能受损时，LPS通过肠道屏障吸收入血，易导致内毒素血症，刺激大量炎性因子产生，这些炎性因子参与维持机体的长期慢性低度炎性反应状态[17]；也有研究发现肠球菌属与脂代谢水平相关，肠球菌属和肠球菌属占总细菌的比例与甘油三酯水平呈显著正相关关系，其比例与高密度脂蛋白呈显著负相关[18]。两种是条件致病菌，其数量的增加，会增加肠道的通透性，容易导致慢性低度的炎症反应状态，出现胰岛素抵抗，从而使长期频繁的夜班工作的医务人员更容易出现肥胖、高血压、冠心病等一系列的代谢紊乱性疾病。

近几年，肠道菌群对人体健康的重要性随着研究的不断深入已逐渐显现出来，人类的肠道内定值的肠道菌群共约500～1000个不同的种属，其细胞总量超过1000万亿[19]。肠道菌群是与人体共生、相互影响的复杂系统，几乎是一个被遗忘的器官[20]。许多研究表明[21]，肠道菌群失调不仅会导致多种胃肠道疾病，如幽门螺杆菌感染、腹泻、便秘、炎症性肠病等，同时还会诱发肥胖、糖尿病、代谢综合征、心血管疾病和过敏疾病等。因此，可以通过调节肠道菌群预防疾病，促进健康，改善症状，缩短病程。

研究发现和事实证明频繁的夜班，工作量大，长期在高风险、高压力下超负荷、快节奏的工作，使机体经常处于应激状态。应激状态下机体内会产生内分泌、神经生化及免疫功能的变化，长期的影响会导致机体内環境失衡，出现多系统的功能障碍，进一步产生焦虑、抑郁情绪异常[22]。同时根据微生态原理，每一个人肠道微生态菌群的形成和结构与其饮食结构和生存环境密切相关[23]。医务人员长时间在细菌、病毒高浓度的环境中工作，也可能引发肠道菌群结构的变化。本研究采用实时荧光定量PCR方法从种属的水平、定量的角度检测长期夜班工作医务人员和非夜班健康人肠道菌群的异常，证实长期夜班工作医护人员的肠道菌群结构发生了显著地变化，存在失调情况。这种肠道菌群结构的失调可能是导致亚健康状态、疲劳综合征、肥胖、代谢紊乱和抑郁症等一系列疾病的早期病理生理基础。在临床治疗中，也可以利用微生态试剂靶向调控肠道菌群结构，并通过改善肠道菌群结构改善亚健康状态及导致的多种疾病。

目前，对肠道菌群的研究多聚焦于某种特定的疾病，只是针对长期夜班工作容易导致的几种疾病有相关研究。如对于肥胖和代谢综合征，诸多研究发现肠道菌群是连接饮食结构异常到肥胖和代谢综合征发生的重要桥梁，其基本机制：影响合成脂肪的基因，导致脂肪过度积累[24]；破坏肠屏障，肠道通透性增加，引发代谢性内毒素血症，从而引发宿主全身的低度、系统性的慢性炎症，诱发胰岛素抵抗，进而导致肥胖、代谢综合征等疾病[25]。关于慢性疲劳综合征，研究发现，与健康人相比，慢性疲劳综合征患者肠道菌群发生了改变，包括双歧杆菌和大肠杆菌的数量减少，粪链球菌则大量增加，部分患者表现有Lactonifactor和Alistipes增多[26]。本研究关于肠道菌群的研究突破了仅仅围绕某种疾病的固有范畴，针对某个特定的职业的特定人群，不但拓展了肠道菌群研究的对象，而且也为更多的职业病及地方病研究提供了一种新的思路和方法。

尽管本研究显示长期夜班工作医护人员的肠道菌群较健康人发生了变化，揭示了长期夜班工作所导致的慢性疾病与肠道菌群之间有密切的联系，但对于两者之间的因果关系和具体机制，仍有众多不确定之处。而且，本研究所用的荧光定量PCR方法，只能检测到肠道中的优势菌，下一步可应用更先进的高通量测序的方法进行研究，期望能更全面地检测肠道中的完整菌群。

[参考文献]

[1] 高秀娟，郭海兰，董霞，等. 医护人员职业紧张状况研究[J]. 护理研究，2004，18（10）：171-172.

[2] Backhed F，Ding H，Wang T，et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（44）：15718-15723.

[3] Cani PD，Amar J，Iglesias MA，et al. Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance[J]. Diabetes，2007，56（7）：1761-1772.

[4] Zhang C，Zhang M，Wang S，et al. Interactions between gut microbiota，host genetics and diet relevant to developmentof metabolic syndromes in mice[J]. ISMEJ，2010， 4（2）：232-241.

[5] HooL L. Bacterial contributions to mamalian gut development[J]. Trends Microbiol，2004，12（3）：129-134.

[6] Round JL，Mazmanian SK.Inducible Foxp3+regulatory T-cell development by a commensal bacterium of the intestinal microbiota[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010， 107（27）：12204-12209.endprint

[7] Armougom F，Henry M，Vialettes B，et al.Monitoring bacterial community of human gut microbiota reveals an increase in Lactobacillus in obese patients and Methano-gens in anorexic patients[J].PLoS One，2009，4（9）：e7125.

[8] Larsen N，Vogensen FK，Van den berg FW，et al.Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults[J]. PLoS One，2010，5（2）：e9085.

[9] Shiba T，Aiba Y，Ishikawa H，et al. The suppressive effect of bifidobacteria on Bacteroidesvulgatus，a putativepathogenic microbe in inflammatory bowel disease[J]. MicrobiolImmunol，2003，47（6）：371-378.

[10] Pompei A，Cordisco L，Amaretti A，et al. Folate production by bifidobacteria as a potential probiotic property[J]. Appl EnvironMicrobiol，2007，73（1）：179-185.

[11] Marteau P，Rambaud JC. Potential of using lactic acid bacteria for therapy andimmunomodulation in man[J]. FEMS Microbiol Rev，1993，12（1-3）：207-220.

[12] Cani PD. Selective increases of bifidobacteria in gut micronora improve high-diet-induced diabetes in mice through a mechanism aLssociated with endotoxaemia[J].Diabetologia，2007，5（11）：2374-2383.

[13] Gibson GR，Wang X. Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria[J].Appl Bacteriol，1994，77（4）：412-420.

[14] Zhou JS，Gopal PK，Gill HS，et al. Potential probiotic lactic acid bacteria Lactobacillus（HN001），Lactobacillus acidophilus（HN017）and Bifidobacterium lactis（HN019）do not degrade gastric mucin in vitro[J]. Int J Food Microbiol，2001，6（3）：81-90.

[15] Sanz Y，Nadal I，Sanchez E. Probiotics as drugs against human gastrointestinal infections[J]. Recent Patents Anti-Infect Drug Disc，2007，2（2）：148-156.

[16] Marzotto M，Maffeis C，Paternoster T，et al. Lactobacillus paracasei A survives gastrointestinal passage and affects the fecalmicrobiota of healthy infants[J]. Res Microbiol，2006，157（9）：857-866.

[17] Schiffrin EJ，Morley JE，Donnet-Hughes A，et al. The inllammatoryStatus of the elderly：The intestinal contribution[J]. Mut Res，2009，690（12）：50-56.

[18] 蔣美玲，许岸高. 2型糖尿病及其前期状态人群肠道菌群特征分析[J].南方医科大学，2010，34（8）：24-28.

[19] Eckburg PB，Bik EM，Bernstein CN，et al. Diversity of thehuman intestinal microbial flora[J]. Science，2005，308（5728）：1635-1638.

[20] Lederberg J，Infectious history[J]. Science，2010，288（5464）：287-293.

[21] 李兰娟.医学微生态学[M].北京：人民卫生出版社，2014：1-300.

[22] 刘继文. 脑力劳动人群紧张干预研究现状和展望[J]. 新疆医科大学学报，2008，33（1）：22-24.

[23] 刘锡葵，李海舟，戴诗梅. 植物配糖体对人肠道厌氧菌群的影响[J].中国微生态学杂志，2000，46（12）：201-208.

[24] Backhed F，Manchester JK，Semenkovich CF，et al. Mechanisms underlying the resistance to diet-induced obesityin germ-free mice[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（3）：979-984.

[25] Cani PD，Neyrinck AM，Fava F，et al. Selective increases of bifidobacteria in gut microflora improve high-fat-diet-induced diabetes in mice through a mechanism associated with endotoxaemia[J]. Diabetologia，2007，50（11）：2374-2383.

[26] Fremont M，Coomans D，Massart S，et al. High-through put 16S rRNA gene sequencing reveals alterations of intestinal microbiota in myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome patients[J]. Anaerobe，2013，22（9）：50-55.

（收稿日期：2017-02-23）endprint